[发明专利]一种编码金属蛋白酶的基因pme16A及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种编码金属蛋白酶的基因pme16A及其应用。 

背景技术

金属蛋白酶（EC3.4.24.-）是指其活性中心，依赖于金属离子的一类蛋白酶。大多数金属蛋白酶主要依赖二价阳离子，如锌离子、铜离子、钴离子和锰离子等。其中Zn²⁺最为普遍。金属蛋白酶容易被金属螯合剂强烈抑制。金属蛋白酶，分布广泛，性质特异，有着重要的经济和应用价值。由于金属蛋白酶的来源不同，所以大多数都具有自己与众不同的特点。一般具有耐高温或者嗜低温、耐有机溶剂、耐碱性、热敏感等特性。目前，金属蛋白酶类主要应用于食品、洗涤剂、化妆品、抗肿瘤药物和疾病机理研究等方面，而且应用于以上各行业中的金属蛋白酶大多源自于动植物，由于动植物源酶来源有限，限制了金属蛋白酶在生产生活上的进一步应用与发展。 

近年来，被确定的锌金属蛋白酶/肽酶的数量逐年增加。金属蛋白酶超家族的成员，都不同程度的涉及胚胎发育和骨骼形成，关节炎和癌症等。对不同金属蛋白酶之间的结构活性研究，有利于我们设计不同的工程金属蛋白酶。将金属蛋白酶的结合位点，引入蛋白质中，可以调节酶的活性，也有可能诱发可预测的特异构象变化。在对金属蛋白酶的氨基酸序列进行比对时，发现它们都拥有一段共同的锌离子结合位点序列HEXXH，其中H代表组氨酸残基，E代表谷氨酸残基，X代表任意的氨基酸残基。两个组氨酸残基，是作为锌的配基，谷氨酸残基作为常见的支点。含有保守的锌结合位点序列HEXXH的金属肽酶都被称为Zincins，根据锌离子第三个配基所在的位置，又把Zincins分成三个不同的族群，Gluzincins，即下游的谷氨酸残基作为锌离子的第三个配基，属于 这一类的金属蛋白酶，包括嗜热菌蛋白酶，肽链内切酶，白三烯A₄水解酶等。 

金属蛋白酶也广泛存在于植物的各种器官或组织中，植物幼嫩部分的含量较多，成熟部分含量较少。如：亮氨酸氨基肽酶（LAP），是广泛存在于植物中的金属蛋白酶，序列和结构都很保守。在寄生虫中，有来自亚马逊利什曼原虫的，亮氨酰氨基肽酶（Lap），它是一个60kDa的蛋白质，与来源于革兰氏阴性菌、植物、哺乳动物中的LaP具有同源性。Eggleson等从食物泡中，纯化并鉴定了一种新的金属肽酶，镰形溶解素（Falcilysin）。这种金属肽酶，出现在疟原虫的天冬氨酸蛋白酶Ⅰ和Ⅱ，以及恶性疟原虫的半胱氨酸蛋白酶血色素水解功能的下游。它不能断裂球蛋白和血色素，但易断裂血色素的多肽片段。镰形溶解素的序列显示了ME家族中M16金属肽酶的特点，具有一个倒转的HXXEH的活性位点基序。通过用随机的多肽对镰形溶解素进行分析，发现重组的镰形溶解素在酸性条件下，具有高度的活性。在中性条件下，也具有较低的活力，但是，却有不同的底物特异性。 

在锌金属蛋白酶中，嗜热菌蛋白酶和羧肽酶A，被认为是典型的模型来研究作用机制。在嗜热菌蛋白中，锌离子具有近四面体的结构，有三个残基提供（His142，His146，Glu166）还有一个是由水分子来提供。进来的底物，取代溶剂分子。锌离子在其中，扮演两个重要的角色，第一，使底物的羰基极化，第二，促进去质子化的水亲核试剂。在羧肽酶A中，在酶的催化中心，Zn²⁺与His196，Glu72，His69结合，它具有以下作用，第一，通过Zn²⁺-OH键极化一个水分子，使其攻击底物易断裂的肽键，从而形成一个四面体的过渡态结构。第二，通过静电作用，稳定过渡态结构中的部分电荷。Arg127、Glu270协助形成过渡态结构，Arg127与底物的羰基结合，Glu270与水分子，通过氢键结合。Arg145，在Asn144和Tyr248的协助下，对底物的结合，具有重要的作用。第225位的氨基酸被认为，是决定底物特异性的关键残基。Mpp（线粒体加工肽酶）是一种金属肽酶，专门裂解N-端信号肽序列。它的活性位点位于一个大的中央腔，在α和β亚基之间，内衬亲水性氨基酸，其中包括谷氨酸和天冬氨酸。信 号肽的底物是富含带正电荷的氨基酸残基，因此，在底物结合区域，带负电荷的残基可以与之结合，形成稳定的静电相互作用的酶和底物。另外，高极性的空腔，不喜欢两亲性的α-螺旋结构。底物可到达活性位点的部位，被富含甘氨酸环（由α-MPP的284-301位残基组成）部分阻止。电子密度被甘氨酸环弱化，显示灵活。Arecent等人的研究表明，Mpp去除这个甘氨酸环后，对底物的亲合力降低以及催化活性降低。这些结果表明，Mpp中富含甘氨酸环，可能与底物的结合或产物的释放相关，可能取决于它的灵活度。