[发明专利]检测铅离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫和离子检测，特别是涉及一种用于检测铅离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其制备方法。

背景技术

铅（Pb）是一种青灰色重金属，是我们所熟知的环境毒物之一，在自然界中分布广泛。随着工农业的发展，铅的用途越来越广泛，在空气、土壤、食品、餐具、玩具中都能觅其踪迹，但是铅污染不容忽视。铅是全身性毒物，具有高蓄积性与多亲和性，可通过消化、呼吸等途径被机体吸收。急性铅中毒多表现为胃疼、头痛、颤抖、神经性烦躁，严重时昏迷，直至死亡。慢性铅中毒大多表现为神经毒性，对血液系统、免疫系统、肾脏等造成一定损害。铅是对儿童威胁最大的环境污染物之一，儿童对铅元素较成人敏感。由于血脑屏障没有发育完整，婴幼儿的血铅水平在达到100μg/L时便可以引起认知功能障碍或发育延迟。

由于铅污染和危害性较大，我国制定了土壤、食品、水体、玩具、用具等涉铅领域中的国家限量标准，农产品安全质量无公害水产品安全要求(GB18406.4-2001)中对铅含量都有限定量≤0.5mg/kg，地下水质量标准(GB/T14848-93)中规定，主要适用于集中式生活饮用水水源及工农业用水的铅离子限量≤0.05mg/L，熟肉制品（GB2726-2005）要求铅含量≤0.5mg/kg。

目前，检测环境铅离子的方法主要有（1）物理和化学分析法：包括紫外分光光度法（UV）、电化学分析法（EC）、原子吸收光谱法（AAS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）、氢化物发生-原子荧光光谱法（HG-AFS）、中子活化分析法（NAA）等。这些方法各有优缺点，紫外分光光度法操作简单，快速，干扰小，但其灵敏度不高；电化学分析法具有灵敏、简便等特点，对操作人员的技术要求高；原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、氢化物发生-原子荧光光谱法具有选择性好、测定精度高、简单、快速等优点，但所用仪器比较昂贵，只能在实验室进行检测，对操作人员技术要求较为严格；中子活化分析法是一种以核反应为基础的分析方法，具有微量、快速、准确和非破坏性且同时可分析多元素的优点，但所需设备不易为一般实验室所具备，很难得到广泛应用。（2）免疫学分析方法：包括酶联免疫吸附法（ELISA）。以竞争性酶联免疫反应为检测原理，反应显色后用酶标仪测定吸光值（OD）值进行结果判定，缩短了检测时间，可以对残留药物进行定性定量检测。但ELISA方法需要配套的酶标仪和配套试剂，操作过程较复杂。 

因此，研制快速、简便、敏感、特异、经济、筛检量大的铅离子快速检测产品，对于减少环境污染、提高食品质量、保障食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题：针对现有铅离子检测技术的不足，制备出铅离子的高敏感性、高亲和力、高特异性的单克隆抗体，以此为基础制备用于检测铅离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其组建方法，该试剂盒能够快速、简便、敏感、特异的检测环境中的铅离子。

本发明的技术方案：

一种检测铅离子的间接竞争酶联免疫试剂盒，包括盒体，盒体内设有用铅离子包被抗原包被过的酶标板、铅离子的单克隆抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、铅离子标准溶液、洗液浓缩液和样品处理液。

所述酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP，浓度均为100 ng/mL；所述底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化脲，显色剂B为四甲基联苯胺（TMB）；所述终止液为2 mol/L的硫酸溶液；所述铅离子标准溶液为铅离子溶解于0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）得到的系列浓度溶液；所述洗液浓缩液为0.1 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20（PBST）；所述样品处理液为0.1 mol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液；用于制备所述酶标板的固相材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

所述的铅离子包被抗原是由以下方法制备的：

（1）称取20 mg 卵清蛋白OVA溶于1 mL浓度为0.01 mol/L、pH值为9.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

（2）称取10mg 异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸鳌合剂（ITCBE）溶于1mL 二甲基亚砜（DMSO）中形成金属螯合剂溶液；

（3）将0.5mL金属螯合剂溶液逐滴加到载体蛋白溶液中，混匀后加入100uL、1.5moL/L的三正丁胺，摇床室温反应24h，制成OVA-ITCBE溶液；