[发明专利]一种基于TTC染色法的高活力酵母细胞定量筛选方法

说明书

技术领域

本发明适用于生物工程技术及医学、药学领域，具体涉及一种基于TTC染色法的高活力酵母定量筛选方法。

背景技术

2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）是一种显色剂,能够对多种细胞（酵母，细菌，植物细胞等）发生呈色反应，TTC本身为无色，当其与正常细胞中的脱氢酶反应而呈红色,其原理是TTC在细胞呼吸中替代O₂接受H⁺，TTC被还原为红色的TTF（三苯基甲月替）而呈现红色。反应方程式如下：

 

由于以上显色反应，TTC作为呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，    能被活细胞中的呼吸链脱氢酶由无色的氧化态TTC还原为红色的TTF，所以，TTC染色法通常被用来测定细胞的活力，

TTC在1894年首次用来检测种子的生存能力，1958年曾被用来染色检测哺乳动物脑组织在缺血梗塞下的细胞形态、梗死面积等，来反映脑组织的缺血梗塞严重程度。目前TTC染色目测法被广泛应用于种子细胞、细菌呼吸活性等的检测，也被应用于高产乙醇酵母的筛选。刘华，梅兴国等人利用TTC法测定红豆杉细胞活力；杨天佑等人利用TTC-脱氢酶测定法研究低温真空环境对细菌呼吸活性的影响；董博宇等人通过TTC染色法筛选紫外诱变后高产乙醇的休哈塔假丝酵母。在呈色反应中产生的TTF在细胞内，且不溶于水，TTF需经有机溶剂萃取，在一定波长下测定其吸光值，其吸收值大小反映了细胞膜电子传递链的递氢能力大小。细胞内TTC反应所呈现的红色的深浅反映了其生命活力的强弱，颜色越深表明其活力越强。在酵母细胞中，乙醇发酵的主要途径包括葡萄糖酵解和丙酮酸的无氧降解，在此过程中糖-乙醇转化酶其主要作用，TTC能对酵母的代谢产物产生显色反应，通过其颜色的深浅可以判断其胞内转化酶活力的大小，颜色越深表明其细胞活性越强，产乙醇能力也越强。

在现有的这些研究中，还存在很多缺陷或者不足。第一是含有TTC培养基的平板制作复杂，接种酵母后生长比较缓慢，并且后续挑取颜色较深的酵母时，操作也比较繁琐，需时较长；第二是通过TTC染色法的呈色反应，利用人眼观测反应颜色的深浅来判断细胞活力从而预测酵母产乙醇的高低，由于待筛选细胞繁多，其缺陷在于：①无法定量，通过肉眼判断无法准确判断生成物含量，且很容易产生疲劳和差错，并且从不同的培养板上筛选所得高活力细胞会因为人眼视力的局限导致误判，使得最终筛选得到的细胞未必是所需高活力高产乙醇细胞；②筛选大量细胞时工作量大，耗时耗力，影响细胞筛选进度。

高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，利用96孔板和酶标仪作为实验工具载体，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，可在同一时间内定量检测大量样品。它具有定量、快速、灵敏和准确等特点。利用高通量筛选技术目前已广泛应用于药物筛选等领域，并已经取得了明显进步。在微生物菌种选育方面，文献报道中也有很多研究者利用96孔板开展选育工作，如张继林等人利用96孔板选育高产乙醇酵母，蔡万林等人利用96孔板和酿酒酵母生长圈符合筛选高产管囊酵母等。但是在这些研究中，亦存在许多不足之处，即这些文献报道只是将微生物培养中用比色杯中测定单位体积内菌体数目的检测转移到96孔板里面进行，后续研究中都需要将细胞培养板96孔中生长OD值较高的菌株涂布于平板培养基生长，再利用其他筛选方法进行高产乙醇菌株筛选，需时长，如蔡万林在利用96孔板和酿酒酵母生长圈符合筛选高产管囊酵母中后续酵母筛选需要生长7-9天。所以，这些方法虽利用了96孔板，但是没有明显减少工作时间及工作量，关键还在于，这些方法在利用96孔板时所测的结果仅仅是对细胞群体密度的定量，反映的是细胞在一定生长周期中的增殖情况，并非个体细胞的生命活力。因此，需要提高细胞筛选过程中的快速性、准确性和简便性。

发明内容

本发明在于提供基于TTC染色法及酶标仪和96孔板的高活力酵母高通量筛选方法，该方法通过酶标仪定量、快速检测，可以有效提高高活性细胞的筛选效率及筛选准确性，以此改进大规模筛选细胞工作量大，进度缓慢，准确性低的不足。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于TTC染色法的高活力酵母细胞定量筛选方法，包含以下步骤：

1）待检测酵母细胞培养：待检测酵母细胞菌液涂布于平板，培养待其长出单菌落；不同酵母细胞的培养时间不一，通常培养48-72h；