[发明专利]重组双靶点蛋白药物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白质药物，及其用于制备治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤主要包括乳腺癌、肝癌等。本发明属于生物医药工程领域。

背景技术

肿瘤细胞的恶性增殖是肿瘤恶性表征的重要标志，这一肿瘤生物学过程包含一系列的细胞信号传导通路的紊乱与异常。大规模系统的肿瘤信号传导通路的筛选表明,下丘脑-垂体-生长轴相关因子在所有已知的促进肿瘤发生发展的信号传导通路中位列第三位。其中生长激素及催乳素激素位于这一机体生长调控轴，在肿瘤的发生和发展过程中起着至关重要的作用。比如生长激素或催乳素得过量表达将显著促进多种肿瘤如乳腺癌和肝癌的发生与发展。因此针对二者的分子靶向治疗途径将大大有助于乳腺癌和肝癌等肿瘤的临床治疗。

传统的肿瘤治疗方法包括手术、放疗、化疗和激素疗法，然而总有大量的肿瘤患者对上述传统的肿瘤治疗方法不敏感从而导致治疗失败。传统的化疗药物的缺陷表现为：1）对肿瘤细胞和正常细胞同样都具有毒性；2）由于肿瘤细胞在基因组上的不稳定性，经过长期的化疗，将导致耐药性的克隆株的出现而导致治疗失效。

本发明的多肽作为人生长激素与人催乳素双靶点抗肿瘤药物，不仅具有高效低毒的特点，还通过导入特异的蛋白质多肽序列从而能发挥长效作用，代表着新一代基因工程肿瘤治疗药物的发展方向。

发明内容

人生长激素与人催乳素在多种人类肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。人生长激素与人催乳素通过结合与各自特异的受体，即人生长激素受体与人催乳素受体而发挥特异性的促进肿瘤恶性增殖与侵袭转移的作用。本发明根据人生长激素与人催乳素各自的受体在分子结构上高度的相似性，设计出能够竞争性地与人生长激素与人催乳素与各自受体结合的重组蛋白分子，从而达到特异性地同时阻断人生长激素受体与人催乳素受体激活的效果，以阻断人生长激素与人催乳素促进肿瘤恶性增殖的能力。

为了提高本药物在体内对肿瘤的杀伤效率，我们还在其羧基端（C末端）插入了两个拷贝的人绒毛膜促性腺激素（hCGB）的羧基端肽段(CTP)，以提高其在体内的稳定性并延长药物的半衰期，从而构建得到OC001多肽。我们将编码OC001的表达载体pIRES-neo转染入中国仓鼠CHO细胞进行瞬时表达可以在细胞培养的上清中检测到重组蛋白多肽OC001的表达。我们将编码OC001的表达载体pIRES-neo分别转染转染入人乳腺癌细胞（及SKBR3及BT-474）及肝癌细胞（Bel-7404），发现表达此蛋白都可以显著抑制这三种细胞的增殖。在CHO-DG44细胞中真核表达OC001并得到纯化后的蛋白，在体外有显著地抑制乳腺癌细胞、前列腺癌细胞和子宫内膜癌细胞生长激素信号功能和肿瘤细胞增殖的能力，药代学分析表明OC001在小鼠体内的代谢速率较生长激素显著降低，半衰期明显延长，表明OC001具有抑制肿瘤细胞增殖的良好活性和显著的长效性。

附图说明

图1是免疫印迹检测CHO细胞上清中的OC001表达。

图2是在人肝癌细胞系Bel-7404和乳腺癌细胞系BT-474和SKBR3中转染OC001表达载体后的活力，可见过表达OC001显著抑制了癌细胞的活力。

图3是ELISA检测稳定表达OC001的CHO-DG44单克隆细胞上清，可见第5号克隆的表达量相对较高。

图4是SDS-PAGE检测经纯化后的OC001重组蛋白。

图5是检测OC001重组蛋白对人乳腺癌细胞T47D生长激素信号的抑制作用，用免疫印迹来检测OC001对STAT5信号的抑制作用，可见在T47D细胞中，OC001可以显著抑制生长激素对STAT5的激活。图6是检测OC001重组蛋白对人前列腺癌细胞LnCAP生长激素信号的抑制作用，用免疫印迹来检测OC001对STAT5信号的抑制作用，可见在LnCAP细胞中，OC001可以显著抑制生长激素对STAT5的激活。

图7是检测OC001重组蛋白对人子宫内膜癌细胞RL95-2生长激素信号的抑制作用，用免疫印迹来检测OC001对STAT5信号的抑制作用，可见在RL95-2细胞中，OC001可以显著抑制生长激素对STAT5的激活。

图8是检测OC001蛋白对人乳腺癌细胞T47D的生长抑制作用，可见在低浓度血清下OC001显著地抑制T47D细胞的活力。

图9是检测OC001蛋白对人子宫内膜癌细胞RL95-2的生长抑制作用，可见在低浓度血清下OC001显著地抑制RL95-2细胞的活力。