[发明专利]一种用于检测样品中重金属铜离子含量的酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于检测铜离子的单克隆抗体及酶联免疫试剂盒。 

背景技术：

重金属污染主要指生物毒性显著地汞、铬、镉、铅以及类金属砷，还包括具有毒性的重金属铜、钴、镍、锡等污染物。随着城市的扩大和大规模工业的发展，大量重金属进入环境后，即使浓度很低，也可能造成危害，通过饮用水，或者通过生物富集以及食物链等方式最终威胁人体健康。重金属污染不同于其他类型污染，具有隐蔽性、长期性和不可逆转性等特点。 

重金属铜是自然界存在的一种重要的金属元素。由于具有多种优良性特性，铜及其化合物在工农业中应用十分广泛。常量铜对农作物或人均是营养物质，而过量时就会产生危害。随着工农业生产的快速发展，铜的用途越来越广泛，用量不断增加，含铜污染物的排放也越来越多，对土壤等环境的污染逐渐显现出来。重金属的污染来源具有多样性，农作物中积累的重金属离子通过食物链的生物放大作用进入人、畜体内，威胁着人、畜健康。重金属污染是食品、环境、卫生监测的重要内容之一，铜及其化合物污染日趋严重并再度成为全球热点问题之一。 

传统的重金属监测方法原子吸收光谱分析、电感耦合等离子发射光谱分析等需要大型的分析仪器，无法用于现场检测，难以适应环境及农畜产品的现场抽查及产品进出口快速通关的要求。与传统的检测方法相比，重金属的免疫分析方法作为一种新型的检测技术具有快速、灵敏和便携等优点。 

因此，铜离子污染已对人类健康构成了严重威胁，建立快速、简便、敏感、特异、经济、筛检量大的铜离子免疫检测技术，对于减少环境污染、提高食品质量、保障食品安全具有重要意义。 

发明内容：

本发明的目的：针对现有检测技术的不足和缺陷，制备出抗铜离子螯合物的高亲和力、特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，以此为基础提供一种用于检测铜离子的酶联免疫试剂盒，能够快速、简便、敏感、特异的检测食品、茶叶、饲料、饮料、土壤、水等样品中的铜离子残留与含量。 

所述的检测铜离子的酶联免疫试剂盒，包括96孔或48孔酶标板、最佳工作浓度的Cu²+ mAb或pAb、最佳工作浓度的RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP、底物显色剂A、底物显色剂B、Cu²+-ITCBE-OVA或Cu²+-ITCBE-BSA包被并封闭好的酶标板、终止液，Cu²⁺螯合物配置的标准品稀释液1～9，洗液(PBST)。 

所述的检测铜离子的酶联免疫试剂盒，用肉眼或酶标仪获取结果，并根据结果分析计算所检测样品中的铜离子含量。 

所述的检测铜离子的酶联免疫试剂盒，所用的铜离子标准品为铜离子与EDTA的螯合物，螯合物中铜离子含量的用电感耦合等离子体原子发射光谱法ICP-AES检测获得螯合物半抗原中Cu²⁺的含量。 

所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为： 

A1、双功能螯合剂的选择：双功能螯合剂1-(4-异硫氰根苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)，对氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTpA)，2-(4-异硫氰根苯基-1，4，7，10-四氮环十二烷四盐酸盐(P-SCN-Bn-DOTA)，然后在碱、酸的作用下，将铜离子螯合在双功能螯合剂上； 

A2、Cu²⁺-ITCBE-载体蛋白人工抗原的合成：采用异硫氰酯法合成铜离子人工抗原。分别称取血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)20mg溶于1mL浓度为10mmoL／L，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸缓冲液(HBS)中形成KLH、BSA溶液。称取10mg金属鳌合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)溶于1mL二甲基亚飒(DMSO)中形成23nmoL／L金属鳌合剂溶液；分别取78.1uL浓度为23nmol／L的金属鳌合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到0.5mLKLH和BSA溶液中，用10mol／L KOH调节pH至9.0，室温下反应24h。制备出铜离子人工抗原Cu²⁺-ITCBE-OVA，Cu²⁺-ITCBE-BSA，Cu²⁺-ITCBE-KLH，-20℃保存备用。