[发明专利]一种鸭源性成分掺假的快速鉴别方法

说明书

技术领域

一种鸭源性成分掺假的快速鉴别方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

在利益的驱动下，使用鸭肉冒充羊肉的掺假事件可谓层出不穷，针对肉类的造假和掺假，目前鉴别肉类掺假的检测方法一般基于PCR技术，而常规的PCR检测需要扩增、电泳及酶切确证三步技术，从检样到报告结果，至少需要5个小时，缺少现场快速筛选的检测手段，使得错检、漏检等现象时有发生，极大地损害了国家利益和消费者利益。因此，发明一种新型肉类成分快速鉴别方法，是当前的迫切需要。

本发明利用金纳米粒子的特殊光学性质，结合特异性的鸭源性核酸序列，结合采用比色方法实现了鸭源性成分的快速鉴别，当样品中含有5%及以上的鸭源性成分即可被检测出来。

发明内容

本发明的目的：提供一种快速的鸭源性成分掺假的鉴别方法，使得现场快速鉴别成为可能。

本发明的技术方案：一种鸭源性成分掺假的快速鉴别方法，步骤为：

鸭源性成分特异性核酸序列的选择：

根据 Genebank公布的潜鸭族的全序列(GenBank：AF090337.1)及绿头鸭的线粒体DNA部分序列(GenBank：EU755253.1)，选择了DNA：5’-CAG CGT CTA CGG CTC CAC CTT CTT TGT CGC-3’这一潜鸭族和绿头鸭共有的特异性序列片段。其中片段长度为30bp，约10nm，该核酸序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成。

（1）结合鸭源性成分特异核酸序列DNA的金纳米粒子探针的制备：

采用表面带负电的金纳米粒子，粒径为5~30nm，浓度为30nmol/L。金纳米粒子的合成方法为柠檬酸三钠还原法，合成及处理步骤如下：量取100mL、0.1g/L的HAuCl₄溶液加至三角烧瓶，搅拌加热至沸腾，5 min后快速加入1~5mL、 10g/L 的柠檬酸三钠溶液，继续加热30min，冷却后，装入分子量12000道尔顿的透析袋，用超纯水透析2天，期间换水3次。取100μL金纳米粒子溶液至1.5mL EP管，用超纯水稀释至1mL，得到3nmol/L浓度的金纳米粒子溶液，加入A₂₆₀=0.27即浓度为10μg/mL 的鸭肉特异性DNA探针10~50μL，振荡混匀，将EP管置于水浴中温育5~30min，水浴温度为25~60℃，此时核酸片段吸附在金纳米粒子表面，得到了具有一定耐盐能力的金纳米粒子探针体系。

DNA：5’-CAG CGT CTA CGG CTC CAC CTT CTT TGT CGC-3’。

（2）样品中核酸片段的提取和处理：

取含有疑似鸭肉成分的肉类，剪碎后，准确称取0.1g置于1.5mL EP管中，加入1mL组织裂解液（10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl，10 mM EDTA， 0.5% SDS，0.4 mg/mL proteinase K），盖上盖子，将EP管置于沸水中煮，时间为10~30min，将EP管于5000rpm离心 10min，吸取上清，上清中加入等体积抽提液（酚:氯仿:异戊醇体积比=25:24:1），混匀，静置5min，5000rpm离心 10min，吸取上层水相上清液，上清液中加入等体积冰无水乙醇，轻轻摇匀，静置15min，用吸头小心吸取析出的DNA’形成的白色絮状物，用70%乙醇漂洗2次，加入100μL超纯水溶解，将提取的DNA’样品进行紫外检测，确认A₂₆₀/A₂₈₀的数值在1.8~1.9左右，并用超纯水调节DNA’浓度，使其A₂₆₀=2.7，此时DNA’浓度约100μg/mL。

（3）鸭源性成分掺假的快速鉴别：

吸取提取处理得到的DNA’样品10~50μL，加至1mL的金纳米粒子探针体系，37℃温育5~30min，探针体系中加入10% NaCl溶液100μL，混匀，静置5min，观察金纳米粒子探针体系的颜色变化，如果DNA’样品中含有鸭肉DNA，则该DNA会与原先吸附在金纳米粒子表面的特异性核酸序列进行特异性结合，形成双链DNA，因此原先的金纳米粒子失去了耐盐能力，在NaCl的存在下，探针体系颜色变成灰色或有蓝灰色沉淀产生，说明检测的DNA’样品中含有鸭肉DNA，且鸭肉占的比例至少为5%；如果探针体系的颜色仍是红色，则说明检测的DNA’样品中不含鸭肉DNA。