[发明专利]一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法

说明书

本发明公开了一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法，通过包被不表达跨膜受体的细胞膜以及表达或高表达跨膜受体的细胞膜，成对、平行地进行差异化ELISA检测，可以大规模筛选针对跨膜受体的单克隆抗体。本发明类似于常规的ELISA，可以高通量、快速、便捷地筛选针对完整跨膜受体的单克隆抗体，具有非常高的检测灵敏度；筛选出来的候选抗体经过FACS验证确认。

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体的筛选方法，特别涉及一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法。

背景技术

G蛋白偶联受体（GPCR）、酪氨酸激酶受体（RTK）以及离子通道（Ion channel）是细胞膜上非常重要的跨膜受体，它们将激素、神经递质、肽类等信号分子转导入细胞内，通过跨膜受体传递并放大信号。目前80％临床使用药物的靶点都集中在跨膜受体上，它们通过与跨膜受体结合而起作用，有的药物激活跨膜受体，有的药物抑制跨膜受体活性，从而影响下游信号的传导，进而改变细胞内生理生化反应。以跨膜受体为靶点的抗体药物，由于治疗性抗体具有非常好的靶标选择性和代谢稳定性，是很重要的一类药物，并日益受到制药界的青睐。

目前，以可溶性蛋白为抗原制备、筛选单克隆抗体相对容易，而制备针对跨膜受体蛋白的单克隆抗体就会非常困难。一方面是因为制备纯化的可溶性跨膜受体蛋白，需要去垢剂维持结构的稳定，但通常在纯化后都会变性，失去特定构象，这样限制了利用纯化的跨膜受体作为抗原来筛选特异性结合的抗体；另一种策略是基于跨膜受体拓扑学和结构预测，合成跨膜受体中亲水区的多肽或串联多肽，并以此作为抗原来筛选抗体，其缺点在于会大量遗漏识别结构性表位的抗体，甚至是筛选出的抗体不识别具有天然构象的跨膜受体。还有一种办法是表达跨膜受体的N’端胞外区，并以此作为抗原来筛选针对跨膜受体的抗体，这种筛选方法也很有限，比如对于某些GPCR来说，它们的N’端胞外区很短，而且具有调控作用的功能性抗体多数是结合在跨膜受体的Loop区。

以完整跨膜受体蛋白为抗原筛选特异性结合抗体的筛选方法也非常有限，通常有流式细胞术（FACS）、全细胞ELISA（酶联免疫吸附剂测定）以及荧光微体积检测技术（Fluorescent microvolume assay technology, FMAT）。其中流式细胞术很难做到高通量筛选，不容易做到超过1000个以上杂交瘤细胞上清的检测；全细胞ELISA需要将细胞固定在96孔板中，因为有内源性的过氧化物酶活性，通常使得检测背景很高，更麻烦的是整个过程需要经过很多次的洗涤，细胞很容易脱落，这样筛选的重复性很差； FMAT采用荧光标记的二抗作为检测手段，信号放大远不及化学发光，那么检测灵敏度很有限。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、快速、高通量且筛选成本较低的跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法，以克服现有技术存在的上述不足。

本发明以内皮素受体ET_AR的抗体的筛选为例，介绍这种快速简便的跨膜受体抗体的筛选方法。受体内皮素受体ET_AR属于七次跨膜G蛋白偶联受体（GPCR）。内皮素受体ET_AR是好的药物靶点，它的抗体可用于治疗肺动脉高压或其诊断。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法，所述方法包括如下步骤：

（1）免疫原稳定细胞株的构建

将带有hETaR基因的载体转染于二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞，在甲氨蝶呤梯度浓度培养下加压筛选，然后用FACS检测，获得高表达hETaR的稳定细胞株；

（2）抗体的制备

用步骤（1）得到的高表达hETaR的稳定细胞株作为hETaR免疫原免疫小鼠后，用FACS方法检测血清效价直至适合抗体滴度（样品的FACS峰值与阴性对照比较，右移1个log单位以上）时，杀死小鼠，获取小鼠脾脏细胞，然后与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合得到杂交瘤细胞；