[发明专利]一种制备印楝细胞培养物杀虫剂的方法

说明书

技术领域

该方法属于生物技术领域。通过组织培养、发酵工程等生产含印楝素的广谱杀虫剂，工艺技术简单、易于推广，其产品为绿色生物农药、易降解、低残留，可广泛应用于农林害虫和仓储害虫的控防。采用这一技术工艺，可以节省印楝种植的耕地、稳定产品的质量、降低印楝素的生产成本。

背景技术

印楝素具有控制多种害虫的作用，一般采用从印楝的种子种仁中提取。印楝主要分布在在南亚和巴西等热带地区，我国在海南、广东和云南等南方地区有一定规模的引种。一般，印楝在成长3-5年后才进人盛果期，因而大规模生产印楝素会受到很大的限制。采用工厂工业化生产可以克服这类缺陷。

发明内容

采用种子、子叶、幼茎等外植体来诱导愈伤组织、并通过继代培养获得松散型愈伤组织；将松散型愈伤组织振荡培养形成小细胞团；进一步继代培养形成分散效果良好的细胞系；经过射线或紫外线照射、振荡培养、过筛、鉴定后获得小细胞突变体；小细胞系悬浮培养的培养基和培养条件优化，并能诱导印楝细胞将积累的印楝素分泌到胞外；印楝培养物：愈伤组织、悬浮培养物、悬浮培养物经过滤分离后的滤液和细胞等经处理后获得四种提取液。四种液体经多种方法浓缩成10-50倍的浓缩液或直接制成冻干粉；它们均可常温密封储存1-3个月；取该类浓缩液或冻干粉加入水稀释成不同浓度的工作液，分别处理饲养20天后黄粉虫幼虫，均可产生显著的控虫效果。

具体实施方式

1采用种子、子叶、幼茎等外植体来诱导愈伤组织

外植体叶片、幼茎和种子用无菌水清洗后，75％的酒精杀菌30s，无菌水反复冲洗3-5次；再用10％次氯酸钠消毒5min，无菌水反复冲洗3-5次；将消毒的外植体分别接种在四种激素组合(表1中1-4号)的MS固体培养基中。25℃黑暗条件下培养25-30天，观察愈伤组织形态特征和发生率(见表2-4)。选择松散型、生长旺盛的淡绿色或淡黄色的愈伤组织进入继代培养。

表1印楝愈伤组织的诱导与继代培养的激素组合

表2植物生长调节物质对印楝种子愈伤的诱导和生长的影响

表3植物生长调节物质对印楝叶愈伤的诱导和生长的影响

表4植物生长调节物质对印楝幼茎愈伤的诱导和生长的影响

2通过继代培养获得松散型愈伤组织

选择松散型、生长旺盛的淡绿色或淡黄色的愈伤组织进入继代培养。愈伤组织(约1g鲜重)转接到新的四种激素组合(表1中的05-08号)的培养基中，在25℃、16h／8h(光照／黑暗)条件下培养20d，观察结果。叶和幼茎愈伤组织继代到与其诱导愈伤的相同培养基上，12d后发现大部分愈伤褐变。而由种子形成的愈伤组织要明显好于叶与幼茎。生长良好的愈伤组织继续进行继代培养；经多次继代培养后，愈伤组织变得更为松散，再进行不同激素组合的生长比较，结果见表5。选择松散型、生长旺盛的淡绿色或淡黄色的愈伤组织进入细胞悬浮培养。其中，NAA3.0+6-BA1.0和NAA3.0+6-BA1.5激素组合更为突出，前者是后续悬浮培养的激素组合。

表5经多次继代后6-BA对印楝愈伤组织继代培养的影响(n＝3，培养20天)

3制备悬浮培养的小细胞团

将经继代培养的松散型愈伤组织(2g，鲜重)在超净台上用镊子夹碎，然后转入含50mL液体培养基(NAA3mg／L+6-BA1.0mg／L，蔗糖3％，MS培养基，pH5.8)的250mL锥形瓶中振荡悬浮培养。摇床的转速120rpm，光照条件为12h／天。在悬浮培养初期，用60或100目的筛子对悬浮培养液进行过滤，滤去较大的细胞团及未完全愈伤化的组织，获得滤液中分散性较好的悬浮小细胞团和细胞体。

4进一步继代培养形成分散效果良好的细胞系