[发明专利]迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂及其冻干方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋细菌冷冻真空干燥保存技术领域，具体地涉及一种适用于迟钝爱德华氏菌的真空冷冻干燥保护剂及其冻干方法。

背景技术

迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，又名迟缓爱德华氏菌，在世界范围内广泛分布于海、淡水环境中，是水生生物的重要致病菌，可引起鱼类、两栖类等多种水产经济动物的疾病，对养殖生产构成严重的威胁（郑大海等2004）。因此，有关迟钝爱德华氏菌的研究逐渐成为水产养殖病原学研究领域的一个热点，国内外学者对迟钝爱德华氏菌的分类、致病机理、抗原特性和疫苗等方面都进行了较为深入的研究（Matt J.Griffin,et al.2013,Jong Earn Yu,et al.2013,Meng Zhang,et al.2012,Seung Hyuk Choi,et al.2011）。

近十年来，随着我国海水鱼类养殖产业的快速发展，由迟钝爱德华氏菌引起的疾病在不同的海水鱼类养殖品种中都有发现。中国水产科学研究院黄海水产研究所从患“脾肾结节症”的大菱鲆脾脏和肾脏中分离到了一株优势细菌，经过深入细致的病原学和病理学研究，证实大菱鲆“脾肾结节症”的致病原是迟钝爱德华氏菌（水产学报，2007年第31卷第4期），并深入进行了迟钝爱德华氏菌和其他常见海水鱼类病原菌的多重PCR检测技术和荧光定量PCR检测技术研究（刘智超，中国海洋大学硕士毕业论文，2012年）。同时，针对包括迟钝爱德华氏菌在内的多种大菱鲆常见病原筛选了一种多效中草药复方（国家发明专利ZL201010100782.8）。这些研究主要集中于迟钝爱德华氏菌感染养殖大菱鲆发病的流行病学、病原学、病理学和防治技术等方面，并未涉及到迟钝爱德华氏菌的长期保存技术研究。

因为迟钝爱德华氏菌是鱼类较为常见且致病力较强的病原菌，已被公认为水生经济动物细菌性疾病病原学研究的模式物种之一。在深入研究了该菌的病原学特性和致病机理等方面后，国内外很多学者研究认为研制开发相应的疫苗是预防迟钝爱德华氏菌病最有效的措施之一，而如何长期保藏具有生物学活性的迟钝爱德华氏菌或其疫苗成为其中的关键技术环节。真空冷冻干燥技术是目前长期保藏微生物菌株并保存其活性最有效的技术方法，非常适宜用于迟钝爱德华氏菌活菌株或疫苗的长久保存。然而，由于迟钝爱德华氏菌自身的生物学特性、生境条件、营养需求、人工培养方法等有其特异性，很难借鉴其他微生物菌株的保存方法，因此寻找合适的真空冷冻干燥保护剂和冻干方法是实现迟钝爱德华氏菌冻干长久保存必须解决的技术难题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于冷冻真空干燥保存迟钝爱德华氏菌菌株的冻干保护剂和具体的冻干方法，能够实现迟钝爱德华氏菌在常温下的长期保藏和保存活力，为深入开展迟钝爱德华氏菌的相关研究提供技术支撑。

本发明采用如下技术方案予以实现：

一种迟钝爱德华氏菌的真空冷冻干燥保护剂，它的组成成份为：脱脂乳粉、乳糖、海藻糖、维生素C、NaCl和无菌蒸馏水。

进一步，所述的迟钝爱德华氏菌的真空冷冻干燥保护剂，它的组成成份及其终浓度为：脱脂乳粉50～150g/L，乳糖50～100g/L，海藻糖100g/L，维生素C 5～20g/L，NaCl 15g/L，溶剂为无菌蒸馏水。

一种所述的保护剂的配制方法为：将脱脂乳粉、乳糖和海藻糖溶于无菌NaCl溶液中，在106℃条件下湿热灭菌30min，自然冷却后配制成溶液A；将维生素C溶于无菌NaCl溶液中，并经0.22μm混合纤维素滤膜过滤后配制成溶液B；将配置好的溶液A和溶液B在无菌条件下混合，并振荡均匀后配制成冻干保护剂溶液，其各成份的终浓度为脱脂乳粉50～150g/L、乳糖50～150g/L、海藻糖100g/L、维生素C 5～20g/L、NaCl 15g/L。

本发明还提供一种迟钝爱德华氏菌的冻干方法。

本发明是按如下技术方案实现的：