[发明专利]高活性中性植酸酶突变体及其基因和用途

说明书

技术领域

本发明属于酶的基因工程和酶生化工程领域。本发明涉及活性提高的突变中性植酸酶，本发明还涉及编码该突变中性植酸酶的基因及用途。

背景技术

植酸酶(phytase)即肌醇六磷酸酶(myoinositol hexaphosphate phosphohydrotase)，是催化植酸及植酸盐水解产生肌醇和磷酸(或磷酸盐)的酶的总称。植酸酶能够将植酸及其盐类水解成肌醇和无机磷，而肌醇和无机磷作为动物的营养元素，对提高动物生产性能有重要意义。

目前，植酸酶主要以添加剂形式用于饲料加工工业和食品加工工业，以提高植物性饲料(或食品)中磷元素的利用率，减少动物粪便中排出的磷对环境特别是水环境的污染，使植酸的抗营养性作用得到解除，并且提高机体对蛋白及多种微量元素的利用率。

来源于芽孢杆菌的植酸酶属于中性植酸酶，其可在pH为中性的肠道中起作用，有效弥补了酸性植酸酶的不足，拓宽了植酸酶的应用范围。当前，国内外关于中性植酸酶的研究主要集中于产酶菌筛选和基因工程菌的构建方面。姚斌等从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中克隆了中性植酸酶基因，并在大肠杆菌中进行了表达，表达产物具有生物学功能但比活较原始酶下降了30％(姚斌，袁铁铮，王元火，等.来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌的表达.生物工程学报，2001，17(1)：11-15)。陈艳等将来源于淀粉液化芽孢杆菌的植酸酶在大肠杆菌中进行了表达，结果发现基因工程菌的植酸酶活性仅为出发菌株的1.27倍，表达重组酶活性偏低(陈艳，孙健义，赵学新，等.Bacillus amyloliquefaciens中性植酸酶基因的原核表达及蛋白纯化和性质.食品与生物技术学报，2005，24(2)：60-65)。近年来，Rao等在大肠杆菌中对芽孢杆菌中性植酸酶进行了高效表达，结果表明其最适pH为7.0，最适温度55℃，最大活性16U/mg(Rao DE，Rao KV， Reddy VD.Cloning and expression of Bacillus phytase gene(phy)in Escherichia coli and recovery of active enzyme from the inclusion bodies.Joumal ofApplied Microbiology.2008，105(3)：1128-1137)。Tung等运用定点突变方法对Bacillus licheniformis植酸酶的热稳定性进行了改善，取得了较好的效果。定点突变结果表明，突变酶G117A/G266A与野生酶具有类似的米氏常数K_m，催化效率k_cat和最适的Ca²⁺浓度，但是热稳定性有大幅上升(Tung ET，Ma HW，Cheng C，et al.Stabilization of beta-propeller phytase by introducing Xaa-->Pro and Gly-->Ala substitutions at consensus positions.Protein Pept.Lett.，2008，15，297-299)。

目前，中性植酸酶在应用过程中还存在一些问题，其中较为突出的就是该酶在高温制粒杀菌工艺中活力损失较大，因此获得高活性的中性植酸酶是近年来的研究热点和难点。利用现代基因工程方法对现有的优良菌株进行改造，是获得高活性突变株的便捷途径。定点突变是蛋白质工程广泛采用的技术，它是根据酶的结构、功能和作用机理等信息，在基因水平进行核苷酸突变，以达到改造酶分子中特定氨基酸残基的目的，使酶的性质最佳化。利用生物信息工具进行蛋白质结构分析与设计，并结合定点突变技术提高淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens DSM1061中性植酸酶的活性，为其应用推广奠定坚实的基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种突变的中性植酸酶，该突变的中性植酸酶与野生酶相比，在40～75℃范围内，活性均有提高，尤其是在50～60℃下，活性比野生酶提高约1倍。在pH7.5条件下，突变酶的活性约为野生酶的3.0倍。

本发明的再一个目的是提供编码上述突变中性植酸酶的基因(核苷酸序列)，该突变的中性植酸酶基因可用于构建重组菌。

本发明的另一个目的是提供上述突变中性植酸酶的生产方法。