[发明专利]一种随机突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体基因及其编码蛋白质和应用

说明书

技术领域

本发明涉及两种谷氨酸脱羧酶突变体基因及其应用，属于分子生物学的技术领域。

背景技术

定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的编码基因，通过易错PCR、DNA重组等技术来改造酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的突变酶。近10年来，定向进化技术已经在酶的相关性质改造领域取得了很多成功的案例，主要集中在提高催化活性，改进底物特异性，提高热稳定性等方面。定点突变（site-directed mutagenesis）属于理性设计，是指在目的DNA片段的指定位点引入特定的碱基对，从而改变其编码的氨基酸序列的技术。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的强有力的工具，也是实验室常用的基因改造的手段。对某个已知的基因的特定碱基进行定点改造、缺失、或者插入，可以改变对应氨基酸序列和蛋白质的结构和功能特征，有助于了解蛋白质结构和功能的关系。尤其是，在利用随机突变等定向进化技术筛选得到具有效果的重要氨基酸位点后，然后对该位点进行定点突变分析，将有助于进一步了解该位点在蛋白质结构和功能的关系中所发挥的作用，所以理性设计和非理性设计的合理结合是蛋白质改造的一种重要技术手段。

谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，简称GAD；EC4.1.1.15）以PLP作为辅酶，催化谷氨酸发生不可逆的α-脱酸反应，过程中消耗一个质子，生成γ-氨基丁酸（γ-aminbutyric，简称GABA)。GAD广泛存在于动物、植物、微生物中，但是在它们的机体里面的功能各不相同。其中在动物中主要是产生GABA，一种中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，因此具有重要的生理功能；在植物中，GAD系统可以抵抗多种压力，如骤然高温、缺氧、钙离子骤增等；在微生物中，特别是一些肠道细菌，如大肠杆菌、乳酸菌等，主要与机体耐酸机制有关，它们的最适pH一般在4～5，在此范围之外酶活力会大幅降低，尤其是当pH大于6时基本失去活性，这使得利用该酶生物合成GABA受到体系pH值的严重限制，因此需要拓宽GAD酶的pH作用范围，使其在偏中性条件下，仍具有较好的活性，解决谷氨酸脱羧酶催化GABA生物合成时，在pH5.5～6.5时，催化能力低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成GABA创造好的条件。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了两种谷氨酸脱羧酶突变体，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示。其编码的突变体酶在偏中性条件下，酶活有明显的提高，解决了野生型的谷氨酸脱羧酶在偏中性pH条件下催化活性低的问题，为利用该酶催化GABA生物合成创造好的条件，氨基酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示。其中SEQ ID NO.3所示突变体是在SEQ ID NO.1所述突变体基础上将312位氨基酸由谷氨酸突变为丝氨酸获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4。

获得SEQ ID NO.2所示谷氨酸脱羧酶突变体的方法为在中国专利CN201110020606.8中公布的gadB1基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第17位的苏氨酸、第294位的天冬氨酸和第346位的谷氨酰胺。

获得SEQ ID NO.4所示谷氨酸脱羧酶突变体的方法为在中国专利CN201110020606.8中公布的gadB1基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第17位的苏氨酸、第294位的天冬氨酸、第312位的谷氨酸和第346位的谷氨酰胺。

本发明还提供了一种针对上述突变体的指示剂平板筛选方法，具体方法为：将突变库中的转化子转移到筛选板上，30℃培养10h后，挑取在菌落周围变绿色的单菌落。筛选板的配方为：在LB固体培养基中含有1.2g/L L-Glu、30mg/L卡拉霉素、1/10000甲基红-亚甲基指示剂，待平板凝固后，在每个培养皿上涂布10μL1M IPTG，然后正面放置30min。

上述突变体基因及其所编码氨基酸在生物合成GABA的应用均属于本发明要求保护的范围。