[发明专利]一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法。

背景技术 

针对微生物检测的方法有多种，目前较广泛使用的有传统的生理生化实验法、免疫抗体检测技术、PCR检测技术等。传统的生理生化实验需要对待测样本的菌种分离培养，通过一系列繁琐的生理生化实验的特征、结果来甄别菌种，该方法虽然是微生物实验室中一种常用的、经典的鉴别方法，但其过程往往需要数天时间、需要耗费较大的人力物力、实验得到的表型特征可能受外界环境影响而出错、对于一些非典型株系及临近种较难根据表型分辨。特别是对于一些处于“活的不可培养状态”（VBNC）的细菌，传统的培养方法难以培养、甄别，这会在水产养殖和食品安全领域留下重大隐患。

PCR检测技术是通过设计特定的引物来大量扩增目的基因片段，根据待检测菌种的相关基因信息来鉴定菌种，PCR技术的灵敏度高而且快捷高效，特别是随着核酸测序技术的跨越式发展，使得PCR技术的耗费更低。但其检测的灵敏度往往受制于琼脂糖凝胶的灵敏度，且同时检测大量样本的能力有限，近年来在普通PCR技术的基础上又衍生出多重PCR技术能在一定程度上解决这个问题，但仍受限于可扩增的基因种类数。

免疫抗体检测技术特异性和灵敏度较高，但往往单次只能检验单一菌种，需要制备抗血清。

基因芯片技术自上世纪90年代以来进展飞速，其在功能基因组研究中作用巨大，随着材料学、机械自动化、全基因组测序等领域的不断发展，使得基因芯片在微生物检测领域也得到了越来越多的应用。基因芯片的基本原理是通过人工合成目的基因的核苷酸片段，点制于一定的载体上（如固相醛基芯片）；提取待测样本的全基因组DNA，通过PCR等方式扩增目的基因片段，并在这些基因片段上标记荧光物质；将之加入芯片上在合适的条件下杂交，同源性高的片段会通过碱基互补配对而结合，经过清洗扫描，会在相应的点处出现荧光信号。

用于微生物检测领域的检测芯片也在原有芯片的基础上得到改进：使用的人工合成的寡核苷酸探针，再结合其他改进使得其特异性和灵敏度极高；荧光标记方法方式多样，大多使用荧光素Cy3标记的单碱基或者随机引物等物质，操作方便、耗费较低；芯片点制、扫描设备的自动化、智能化水平也在逐渐提高，可以大幅缩短检测时间、减少人为误差；芯片的高通量性体现在芯片打印密度的提高（目前已能达到每平方厘米打印10⁴个探针），这在环境监测、食品检测中的大量、复杂样品的检测方面优势明显。

本发明的溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌的基因芯片检测芯片能够实现对复杂样本的并行快捷、高通量、高特异性、高灵敏度检测，在此四种病原弧菌的基础上其还具有良好的可扩展性，这对于海水环境病原微生物的监控检测具有实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可并行检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌的基因芯片及其检测方法，从而弥补现有技术的不足。

已有的基因芯片常常利用编码热休克蛋白的hsp60基因来做为菌株种类鉴定靶基因。该基因属于管家基因，其在细菌中广泛存在且具有种特异性差异，在当前的细菌分类学中通常被用为种类鉴定、系统发生分析的靶标。然而管家基因建立的鉴定探针只能鉴定到病原菌株的种类，在复杂的水产养殖环境中，往往同一菌中的不同株系其致病性有无、强弱也有差异，因此了解相关毒力基因是否存在具有实际意义。而申请人在长期的研究中发现，编码跨膜转录调控蛋白的toxR基因能够作为鉴定毒力基因的分子靶标，该基因对于致病菌株的毒素的产生具有关键性的调节功能，在致病菌株中也广泛存在。因此，本发明针对溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌的这两种基因分别选取特异性片段设计探针，以保证各个菌种探针只和对应的菌种产生特异性信号。

本发明的一种可并行检测多种弧菌的基因芯片，包括有芯片载体，在芯片载体上固定有用于检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和创伤弧菌的核苷酸探针；

所述的用于检测溶藻弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因和/或toxR基因中设计的；

所述的用于检测副溶血弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因和/或toxR基因中设计的；

所述的用于检测哈维氏弧菌的探针是从溶藻弧菌的toxR基因中设计的；

所述的用于检测创伤弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因中设计的。

所述的用于检测溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。