[发明专利]一种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医用检测试剂技术领域，尤其涉及一种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒。

背景技术

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡的主要特征表现在细胞萎缩、胞膜结构的改变、核染色质致密、内源性核酸酶性切割基因组DNA。

早期细胞凋亡检测是形态学观察方法：⑴HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。⑵丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。⑶台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。⑷透射电镜观察：凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

上述方法操作简单，初学者即可很容易掌握，但是上述方法的准确度很差，也就是说很难区别凋亡细胞和坏死细胞。形态学观察只是一种辅助的手段。

目前最为经典和最被承认的方法是DNA凝胶电泳方法。其

检测原理是：

细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180~200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

结果判断是：

正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（Ladder）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。

该方法存在操作繁琐的缺点，需要操作人员具有一定的实验技术的积累，所以较难以掌握，但是该实验结果是最被人认定凋亡的结果。这也更加说明该实验的重要性和对简化该实验操的研发的必要性和迫切性。

现有的Apoptotic DNA Ladder 提取试剂盒为或为进口产品，价格昂贵；同样的提取试剂盒在美国购买需要两百多美元，而如果从国内找代理商购买，则需要四千多人民币，仅价格上就提高了4倍，而且还很难避免所购买试剂盒因为长途运输造成的质量问题。

国产产品，效果不是很好，比如常常混有基因组DNA。⑴以碧云天开发的Apoptotic DNA Ladder提取试剂盒，其原理是将所处理细胞的所有DNA都提取出来，用孔径较小的离心柱将所提取的DNA分离和洗脱下来。该方法优点是操作方法简单，容易掌握，缺点是所提取的产物除凋亡DNA还混有总基因组和坏死细胞的长度不规则的DNA。这样跑出的DNA凝胶电泳效果可想而知，凋亡DNA ladder之间（条带与条带之间）区分度很差，最终导致实验结果效果很差。⑵又或者虽不是离心柱分离洗脱，但是由于其裂解液用的是裂解较强的基因组裂解液，而且裂解时间较长，这样势必提取产物中混有较大量的基因组DNA，会在一定程度下掩盖所提取的凋亡DNA ladder 的效果。⑶用分离萃取的方法抽提蛋白，也就是用氯仿、饱和酚分离提取。这样做的缺点是一是增加试验成本，第二是步骤繁琐，毒性较大，一般在通风橱里操作。而且由于抽提蛋白的过程，凋亡DNA ladder有一定损失。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、快速、可定性检测的改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒。

为解决上述问题，本发明所述的一种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒，包括

—细胞裂解液，用于将凋亡细胞中的凋亡的核小体在10秒钟内提取出来；

所述细胞裂解液由0.121g~0.200g Tris、2.340~3.000g NaCl、0.029g~0.040gEDTA、1mL~2mL Tritan-x组成；

—提取试剂酶A液和B液，用于将凋亡的核小体中混有RNA酶和核小体蛋白除去；

所述A液由250μL中含有250μg RNA酶的水溶液组成；

所述B液由250μL中含有500μg蛋白酶K的水溶液组成；

—醋酸铵溶液；

所述醋酸铵溶液由1mL中含有790mg 醋酸铵的水溶液组成；

—DNA ladder溶解液；