[发明专利]以诱导独一味种子萌发幼苗为外植体的组织培养试管苗获得方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种独一味组织培养获得试管苗的方法，特别是涉及一种以独一味种子诱导苗为外植体的组织培养试管苗获得方法。

背景技术

独一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo，为唇形科，独一味属植物，该属仅有独一味一个种。主产西藏，青海，甘肃，四川西部及云南西北部；生于高原或高山上强度风化的碎石滩中或石质高山草甸、河滩地，海拔2700-4500米。具有典型高山植物特征，如植物矮，茎短，根系发达，叶片较大，贴地展开。这些特征与其生长环境为高寒缺氧、干旱风大、辐射强及昼夜温差大等有关。

独一味属于传统藏药，民间用全草入药，治跌打损伤、筋骨疼痛、气滞闪腰、浮肿后流黄水、关节积黄水、骨松质发炎。此外据青海对大白鼠股动脉、肱动脉、颈动脉横切断止血试验，认为本种有较好的止血效果。随着野生独一味的存储量逐步降低，对独一味的研究也越来越受到重视。对将独一味引种到低海拔地区的研究工作也有部分开展。如金兰等通过将独一味根茎芽从海拔4300m的野生地移栽到海拔2366m和3100m的实验基地后，对移栽地独一味的花粉活力，花粉萌发及自然结束率进行了统计，结果发现独一味移栽到较低海拔后花粉活力低，柱头上无花粉萌发，自然结实率为0。因此，在低海拔地区对独一味的种苗获得，以植物组织培养方式更为可行。然后，独一味成株茎短，约1cm，叶片大，具皱，密布绒毛。这些特征使采用独一味成株为外植体时，灭菌获得无菌苗难度很大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以诱导独一味种子萌发幼苗为外植体的独一味组织培养试管苗获得方法。

为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤：

（1）选取当年收获健康饱满，具有活力的独一味种子，播种于浸有GA₃ 50mg·L^-1的滤纸上进行催芽，待幼苗长至约1cm后,，喷施一次800倍液的多菌灵进行植株的表面消毒杀菌预处理，然后收集幼苗。

（2）先将作为外植体的独一味幼苗用800倍多菌灵溶液侵泡30min，再用自来水冲洗1h左右，，放入超净工作台内用浓度为75%的酒精消毒10s，无菌水冲洗3次，接着用浓度为0.1%的升汞消毒5min，最后用无菌水震荡洗4～6次，用无菌滤纸吸干幼苗表面的水分备用；

（3）在无菌条件下用手术刀在独一味幼苗上划出伤口，接种于愈伤组织诱导培养基:MS+6-BA 0.5mg.L-1+NAA 1.0mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂4.8g·L^-1中进行愈伤组织诱导，所采用的pH值为6.0，培养温度20℃、光照时数10h/d、光照强度为1000～1500Lx，培养时间30d；

（4）30d后，选取颜色黄绿、有瘤状突起质地良好的愈伤组织作为外植体，接入丛生芽诱导培养基：MS+6-BA 1.0～3.0mg·+NAA 0.1～3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂4.8g·L^-1中进行丛生芽的诱导，所采用的培养基pH值为6.0，培养温度为20℃、光照时数12h/d、光照强度为1200～1800Lx，培养35d后，愈伤组织诱导分化出大量丛生芽。

（5）根的诱导培养，待丛生芽长至2cm时，将丛生芽分成单芽，转接到生根培养基：1/2MS+IBA 0.5mg·L^-1+NAA 0.1mg·L^-1+蔗糖15g·L^-1+琼脂4.8g·L^-1，中诱导生根20d后,待不定根长至2-3cm时，即可移至高海拔地区温室大棚内进行炼苗移栽。

采用上述方案，本发明以种子萌发苗为外植体，可以有效的降低外植体接种后的污染率，快速在低海拔地区获得独一味组织胚芽试管苗。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

（1）选取饱满、有生命力的独一味种子，用清水清洗后，阴干。放入浸透50g·L^-1GA3的滤纸上，20℃培养，诱导萌发直到胚根和胚芽突破种皮长出，平均萌发率31.4%。长出后第4d，开始每日用800倍多菌灵喷施到平皿，连续喷施4d后，收集幼苗，用自来水冲洗干净，然后阴干，再在超净台用浓度为75%的酒精消毒15s，接着用浓度为0.1%的升汞消毒5min，最后用无菌水震荡洗5次，洗后用已灭菌的滤纸反复吸干幼苗表面的水分；