[发明专利]一种运用根癌农杆菌介导的水稻转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种运用根癌农杆菌介导的简单、快速、高效的水稻转化方法的建立，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。

背景技术

人口、资源、环境一直是人类生存与发展所面临的主要问题。近年来，由于人口增长、气候变化等因素，出现了全球性的粮食短缺，主要农产品价格快速上涨，在世界范围内造成了粮食危机与恐慌。而水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，进一步提高水稻产量具有极其重要的意义。但是，可利用的耕地和淡水资源逐年减少，大量使用农药、化肥导致环境严重污染同时增加了农业生产成本和农民负担，农业生态系统遭受严重破坏，因此，确保粮食安全的根本途径在于提高作物单产。依靠惯有方法很难培育出在产量潜力上有大突破的新品种。近二十几年来，通过转基因技术培育转基因高产作物不断传出佳讯。转基因技术作为一种可持续发展的方式，可提高农作物产量和品质，具有良好的发展潜力和前景，将为世界农业发展注入新的动力^[1]。

目前，在水稻育种上相继开发研究的转基因技术有以农杆菌为主导的载体介导转基因技术；以基因枪、PEG等介导的基因直接导入技术和以花粉管通道转化、生殖细胞浸泡吸收为主的种质系统转化技术，尤以农杆菌介导技术、基因枪导入技术和花粉管通道技术的研究报道最多，其中农杆菌介导技术占64%^[2]。

以载体介导的转化，即利用另一种生物来实现基因的转入和整合，主要的方法就是农杆菌介导法。农杆菌细胞内的Ti质粒或Ri质粒具有一段T-DNA，可通过农杆菌侵染植物伤口进入细胞，并插入到植物基因组中。通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染，可实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株^[3]。自从1978年Chilton等^[4]第一次利用农杆菌的Ti质粒为载体将T-DNA上的胭脂碱基因转入烟草细胞以来，根癌农杆菌在双子叶植物转化中得到了广泛应用。1986年，Baba等^[5]通过PEG法将农杆菌原生质球与水稻原生质体融合，获得了能够合成胭脂碱的水稻转化组织。之后，科学界开始对农杆菌介导的水稻转化进行了广泛的研究，试图通过转基因技术来提高水稻产量、改良品质和增强抗性^[6-8]。但是，由于国内外各个实验室所使用的基因型、外植体的不同和培养环境条件的差异，造成了各个转化体系中的结果不尽相同，转化率也普遍不高。所以，近二十几年来，不同研究人员分别从Ti质粒的改造、转化载体的构建和组织培养方面入手，不断优化农杆菌介导的水稻转化方法，以期提高转化效率。一是选择最适农杆菌及优化载体。由于不同基因型水稻接受农杆菌菌株的亲和性不同，所以选取合适的农杆菌菌株和优良的质粒对转化来说非常重要。用于水稻转化的农杆菌菌株较为普遍的有A281、A656、LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1。李双成等^[9]以3个籼稻品种和2个粳稻品种为对象，对农杆菌转化水稻过程中影响转化效率的因素进行了研究，发现菌株AGL1和EHA105按一定比例混合共转化，对抗性愈伤率有显著影响。现在水稻农杆菌介导应用最多的是EHA105菌株。

对天然Ti质粒的改造，最初只有共整合载体到现在的共整合载体、双T-DNA载体、双元载体、超级双元载体都可利用；在转化频率不断提高的同时，在去选择标记上也不断取得进步。1996年，Komari等^[10]构建了所谓的“超级双元载体”，以该载体转化农杆菌LBA4404菌株，阳性菌液侵染水稻愈伤组织，共转化率可达47%，转化植株自交后代中，约65%的植株只含报告基因而不含标记基因。2004年，殷丽青等^[11]运用农杆菌介导的双T-DNA法培育含反义蜡质基因的无选择标记水稻，获得了55.4%的共转化率，转化植株自交后代有29.2%的植株中只含有目的基因而不含选择标记基因。夏志辉^[12]利用DRB双元载体培育无选择标记的转基因水稻。2005年，朱祯、李旭刚发明了一种利用双T－DNA载体培育无选择标记转基因水稻的方法，单子叶植物表达载体中含两个独立T－DNA结构域且带MAR(matrix attachment region)序列，提高了获得稳定的无选择标记的转基因水稻的比率，并将该体系申请了专利^[13]。2007年，朱丽等^[14]尝试利用共转化和花药培养技术相结合，快速获得了纯合的无选择标记的三价转基因水稻。这种方法仅需要一代即可获得纯合的目的植株，大大加快了研究进程。