[发明专利]转植酸酶基因玉米外源基因插入位点旁侧序列及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因植物外源基因插入位点旁侧序列及检测方法，具体涉及一种转植酸酶基因玉米外源基因插入位点旁侧序列及检测方法。

背景技术

玉米是世界粮食三大主力作物之一，是重要的粮食作物和重要的饲料来源，也是全世界总产量最高的粮食作物。随着现在生物技术的发展，转基因玉米也迅猛增加。自从1996年转基因作物大规模商业化种植以来，转基因玉米成为世界上第二大已商业化转基因作物，截止到2012年底，全球已有28个国家共种植了25种转基因作物，种植面积达到1亿7千3百万公顷，其中转基因玉米种植面积超过5500万公顷，占玉米种植面积的35%。尽管我国目前还没有批准转基因玉米的种植，但已批准了国外9个转基因玉米品系进口用作加工原料。

2009年8月，我国批准了自主研发的转植酸酶基因玉米BVLA430101的安全生产证书。它是通过基因枪转化法将黑曲霉中的植酸酶基因转入到玉米中，经过多代筛选培育而成的。转入植酸酶基因的目的是降解玉米中大量含有的植酸，释放可被动物利用的无机磷，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本，减少动物粪、尿中磷的排泄，减轻环境污染，具有广阔的应用前景。Chen等2008年报道了转植酸酶基因玉米研发所采用的启动子、终止子和目的基因(Rumei Chen，Guangxing Xue，et al.Transgenic maize plants expressing a fungal phytase gene.Transgenic Res.2008，17：633-643.)，但并没有提供外源基因整合位点、旁侧序列以及相应的特异性检测方法等信息。对转基因检测来说，外源基因整合位点及旁侧序列至关重要。2010年，谢家建等人报道了转植酸酶基因玉米BVLA430101完整表达框序列以及构建PCR方法（专利公开号为CN101792811A，公开日为2010年08年04），同时他们揭示了该玉米品系转化体外源插入片段的5’端旁侧序列，并基于此序列信息建立了PCR定性检测方法（专利公开号为CN10172812A，公开日为2010年08年04）。然而，目前为止还没有任何文献报道该玉米品系外源插入片段的3’端旁侧序列及其基于此序列信息建立的3’端品系特异性PCR定性检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体外源插入片段的3’端旁侧序列，并依据该3’端旁侧序列建立了3’端品系特异性定性PCR检测方法，该检测方法能够快速、准确、灵敏地鉴定出转植酸酶基因玉米BVLA430101，以及以转植酸酶基因玉米BVLA430101为亲本的衍生品种。

本发明的第一个目的通过以下技术方案实现：一种转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3’端旁侧序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的第二个目的通过以下技术方案实现：一种转植酸酶基因玉米BVLA430101转化体品系特异性定性PCR检测方法，包括以下步骤：

步骤1，提取玉米基因组DNA模板；

步骤2，依据SEQ ID No.1中1～3655bp位序列设计正向引物，依据SEQ ID No.1中3656～5299bp位序列设计反向引物；

步骤3，配制PCR反应体系，包括以下组分：所述正向引物、所述反向引物、Taq DNA聚合酶，10×PCR Buffer，dNTP，所述玉米基因组DNA模板；

步骤4，将所述PCR反应体系进行PCR扩增反应；

步骤5，将扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，若能够扩增出206bp的产物，则样品为转植酸酶基因玉米BVLA430101。

优选的，步骤2中，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

更优选的，步骤3中，所述反应体系包括以下组分：10μM的所述正向引物1μL、10μM的所述反向引物1μL、5U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL、2.5μL含Mg²⁺的10×PCRBuffer、2.5mmol/L的dNTP2.5μL、20ng/μL的所述玉米基因组DNA模板1μL，加灭菌蒸馏水补足体积至25μL。

最优选的，步骤4中，所述PCR扩增反应的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃，7min。