[发明专利]检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的引物、探针及方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属微生物检测领域，涉及检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的引物、探针及方法和试剂盒

背景技术

蜡样芽孢杆菌是一种需氧、中温、产芽孢的杆菌，是一种食品和化妆品中常见的污染菌。该菌在自然界广泛分布，几乎所有种类的食品都曾被报道与蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒有关。蜡样芽孢杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类，在亚洲以呕吐型为主，而在欧洲和北美地区则以腹泻型更为常见，除此之外还能引起其他一些非胃肠性感染。由于蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒症状通常较温和，且不超过24h，导致大量零星发生的蜡样芽孢杆菌食物中毒事件未被报道，蜡样芽孢杆菌感染数量大大被低估。而据挪威和荷兰系统监控的结果显示，蜡样芽孢杆菌是食品中最常检出的食源性致病菌（Beattie S H,Williams A G.Detection of toxins[M]//Encyclopedia of food microbiology.London:Academic Press,2000:141-149.）。

呕吐型蜡样芽孢杆菌食物中毒是其在食物中生长时产生的耐热呕吐毒素cereulide所致。Cereulide具有抗高温性，可耐受强酸强碱或胃蛋白酶。根据已知的非核糖体依赖的肽合成酶（NPRS）基序设计兼并引物扩增并测序得到蜡样芽孢杆菌呕吐毒素合成酶基因（简称ces基因），且已证明在不产生cereulide的蜡样芽孢杆菌菌株中检测不到ces基因（Ehling-Schulz M Vukov N Schulz A.Identification and partial characterization of the nonribosomal peptide synthetase gene responsible for cereulide production in emetic Bacillus cereus J.Appl Environ Microbiol.2005711105-113.）。

目前对蜡样芽孢杆菌的检测主要采用常规分离培养、生化检测方法，这些传统方法费时费力，需较长时间的选择性增菌培养过程，存在通量小或条件要求高等缺点，不适合大规模广泛应用。且因为cereulide的分子量很小，无抗原性，因此对呕吐毒素的检测极为困难，目前常用的是采用Hep-2细胞进行细胞培养分析和毒素导致精子运动能力下降的定性和半定量检测，缺乏一种快速可靠的检测方法。

近年来PCR技术等分子生物学方法开始应用于蜡样芽孢杆菌的快速检测。有文献报道基于SYBR Green Ⅰ染料建立的实时荧光PCR方法，可实现对呕吐型蜡样芽孢杆菌的快速检测（王振国，刘金华，蔡阳等.应用实时荧光PCR检测致病性蜡样芽孢杆菌[J].生物技术通讯，2006，17(1):40-42）。但SYBR Green Ⅰ染料除可与目标片段结合以外，还可以与引物二聚体等非特异性产物结合，因此检测时特异性较差，且无法进行多重实时荧光PCR检测。

实时荧光PCR技术目前已广泛应用于多种微生物病原的快速检测中，如常见的食源性致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌等。其原理为在核酸扩增反应中，探针与目的片段结合，基于Taq酶的5’至3’端外切酶活性，探针在扩增延伸阶段被水解，3’端荧光淬灭基团（Q）对5’端荧光报告基团（R）的抑制作用消失，荧光信号增强，从而进行目标核酸片段的检测。相比较于普通PCR，实时荧光PCR无需PCR后处理、有效避免PCR产物污染，且起点定量法比普通PCR方法的终点定量法更准确可靠。与SYBR Green Ⅰ的实时荧光PCR方法相比较，探针法实时荧光PCR技术具有特异性更强、灵敏度更高的特点，可在单管中实现多重检测，有利于高通量、自动化操作和联网管理等优势。由于蜡样芽孢杆菌有多种不同特性的基因，只针对一种基因做单一检测，极易造成漏检。在同一个反应体系里，同时对不同的靶基因进行扩增，能全方位地检测蜡样芽孢杆菌。多重检测与实时荧光PCR结合后，省去了核酸电泳的结果分析，进一步简化操作。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供和设计一套特异、敏感地检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的特异性引物和探针序列，并在这套序列的基础上建立一种基于实时荧光PCR的快速检测方法，提供一个呕吐型蜡样芽孢杆菌快速检测试剂盒，对蜡样杆菌进行种属鉴定的同时区分呕吐型蜡样芽孢杆菌。

为了实现本发明目的，本发明首先提供了设计和筛选特异性引物探针的技术方案。

1、筛选目标基因