[发明专利]一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法

权利要求书

1.一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，包括：

（1）采集不同群体的西施舌个体，取西施舌样品的闭壳肌组织，提取基因组总DNA，洗脱定溶于TE溶液或双蒸水中，-20℃保存，备用时于4℃保存；

（2）以ITS2-F:5′-GGGTCGATGAAGAACGCAG-3′和ITS2-R:5′-GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3′为引物，进行ITS2序列的PCR扩增；然后PCR扩增产物经1.2%-1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测完毕进行切胶并利用PCR产物纯化试剂盒纯化回收，纯化产物进行双向测序列，其中无法直接测序的PCR产物，经克隆并进行菌落PCR检验后再测序；应用软件进行不同序列比对，得出特异性位点，判断样品所属。

2.根据权利要求1所述的一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的TE溶液浓度为100ng/μl。

3.根据权利要求1所述的一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的PCR扩增的反应体系为30μL，每个反应体系内含：50ng/μL的模板DNA1μL，20mM Mg²⁺的10×buffer2.5μL，5mM each dNTP1.0μL，5μM的引物各1.0μL，Taq酶聚合酶1U，加ddH₂O至30μL。

4.根据权利要求1所述的一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的PCR扩增反应具体为：反应前94℃预变性4min，接着为35个循环的反应，条件为94℃40s，52℃30s，72℃60s，最后72℃延伸7min。

5.根据权利要求1所述的一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于：所述步骤（2）中以DL500标准DNA Marker为分子量标识进行切胶。

6.根据权利要求1所述的一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的克隆具体为：将纯化好的PCR产物片段连接入载体中T-easy VECTOR，体系10μL：其中T4连接酶1U，2×快速连接buffer5μl，PCR产物2μL，T载体1μL；16℃反应1h，将全部连接产物加入100μl的JM109感受态细胞进行转化，转化过的含感受态细胞的菌液均匀涂布于添加IPTG和X-gal的氨苄青霉素LB平板上，37℃培养过夜；挑选白色单一菌落，接种于450μL的LB培养液中，37℃震荡培养到指数级生长或可见云雾状；取1μL培养液做菌落PCR，检测插入的片段，选2个阳性克隆进行测序。

7.根据权利要求6所述的一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于：所述IPTG用量为100μl，浓度为10mmol/L；X-gal用量为100μl，浓度为2%；培养过夜具体为培养16h。

8.根据权利要求1所述的一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的菌落PCR反应条件为：15μL的反应体系：Mg²⁺2.5mmol/L，dNTP0.25mmol/L，引物0.25μmol/L，Taq酶1U；反应条件为94℃预变性5min，之后进行30循环：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸120s；最后，72℃延伸5min。