[发明专利]表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌株

说明书

（一）技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达具体地说是以嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-CT-9C。 

（二）背景技术

糖苷水解酶（英语：Glycoside hydrolases，又称糖苷酶）是一种专门水解配糖键（glycosidic bond），并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。 

嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶和9家族糖苷水解酶。 

嗜热毛壳菌产生的9家族糖苷水解酶CtAA9C具有微弱的纤维素酶活性，但对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用,可使其活性提高1.4倍。在不同金属离子如Mn²⁺的作用下，CtAA9C和CtAA9C+N24的活性可分别提高15倍和3.5倍。 

（三）发明内容

本发明从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得内切β-1,4-葡聚糖酶基因的cDNA序列全长，命名为CtAA9c，CtAA9c基因DNA全长1020bp，包括信号肽序列，起始密码子和终止密码子，无内含子，编码313个氨基酸，具有信号肽序列（1-26aa MPPSTSSLLSILLTLSSTLIPDPVFA）。将CtAA9c编码的氨基酸序列在 国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。 

构建重组表达质粒载体pPIC9K/CtAA9c，利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-CT-9C。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃200rpm/min摇床培养6d后，糖苷水解酶的表达量为3.24mg/ml，分子量为65KDa，酶活力为0.0483U/ml，CtAA9C在65℃下是稳定的，处理60min后仍有95%以上的酶活性；70℃处理30min后仍保持74.4%的活性；80℃处理30min后保持24.8%的活性；90℃处理30min活性几乎完全丧失。 

9家族糖苷水解酶CtAA9C对嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力提高1.4倍。不同金属离子对CtAA9C和CtAA9C+N24混合酶活性具有促进或抑制作用，其中在Mn²⁺条件下，CtAA9C和CtAA9C+N24的纤维素酶活性可分别提高35倍和3.5倍。 

（四）附图说明：

图1 9家族糖苷水解酶CtAA9C的SDS-PAGE分析 

泳道1：低分子量蛋白标准 

泳道2：纯化的9家族糖苷水解酶CtAA9C 

图2 A:9家族糖苷水解酶CtAA9C的最适温度 

B:9家族糖苷水解酶CtAA9C的热稳定性测定 

图3  9家族糖苷水解酶CtAA9C对内切纤维素酶N24活性的促进作用 

图4  金属离子Mn²⁺对CtAA9C纤维素酶及混合酶活性的影响 

（五）具体实施方式

实施例1：嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum的分离鉴定 

（1）标本采集：从堆肥中采集。 

（2）分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。 

（3）鉴定:参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。 

实施例2：糖苷水解酶基因CtAA9c的克隆 

（1）嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。