[发明专利]一种筛选血管内皮生长因子1激酶抑制剂高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶(VEGFR)抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对VEGFR激酶抑制活性的高通量检测。

背景技术

VEGFR家族主要包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1／KDR)、VEGFR-3(Flt-4)三个成员，属于受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)，由3部分组成，包括胞外的7个免疫球蛋白样结构域、跨膜区和胞内的酪氨酸激酶活性区。VEGFR-1是VEGF-A、VEGF-B和PIGF的高亲和性受体，存在于血管内皮细胞、造血干细胞、巨噬细胞和单核细胞表面，与这些细胞的迁移有关。受体或相应配体的过量表达，会通过多条路径、多种机制激活细胞内信号转导，信号蛋白进入细胞核激活转录因子，导致细胞增殖失调、凋亡抑制、血管生成、细胞侵袭和转移等，进而导致肿瘤和其他相关疾病的发生。VEGFR酪氨酸激酶抑制剂作用于VEGFR信号转导过程的最上游，能阻断多条通路，具有治疗范围广、疗效高和不易耐药等优点。因此，研究VEGFR激酶抑制剂具有重大意义。

时间分辨荧光技术(time-resolved fluorescence，TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。

目前，已有多种VEGFR1激酶抑制剂的筛选方法，多利用ELISA法来筛选VEGFR1激酶抑制剂，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。

本发明的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制VEGFR1激酶活性的候选化合物。具体步骤如下：

本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型。

步骤一：VEGFR1激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。

步骤二：阳性药验证模型可靠性。

步骤三：高通量筛选模型验证。

附图说明：

图1：VEGFR1激酶浓度梯度优化实验结果。

图2：VEGFR1激酶温孵时间优化实验结果。

图3：VEGFR1激酶底物浓度优化实验结果。

图4：VEGFR1激酶ATP浓度优化实验结果。

图5：阳性药十字孢碱对VEGFR1激酶的抑制曲线图。

图6：VEGFR1激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。

图7：高通量筛选Z′值分布。

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

1.VEGFR1激酶抑制剂筛选方法建立

(1)实验材料

VEGFR1激酶检测试剂盒(Cisbio，法国)、VEGFR1激酶(Invitrogen，美国)、ATP(生兴，中国)、十字孢碱(碧云天，中国)、384低体积白板(Corning，美国)、枪头(Axygen，美国)。

(2)实验步骤

1)进行VEGFR1激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验，见图1-4。

2)待测化合物精确称量，加入DMSO溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为1×10^-3mol／L。