[发明专利]一种酿酒酵母工程菌生产β-香树脂醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酿酒酵母工程菌的构建及发酵生产β-香树脂醇的方法，属于生物化工领域。 

背景技术

萜类是一类具有特殊价值的植物次生代谢产物，在抵御感染、紫外辐射、干旱等生物和非生物胁迫方面具有重要功能，许多萜类物质显示出抵御人类疾病的药物活性。甘草酸是中国传统药用植物甘草的最重要萜类化合物，具有抗感染、抗炎、抗溃疡、抗病毒和防治肿瘤等多方面的作用。β-香树脂醇是甘草酸生物合成的重要前体物，不仅具有与甘草酸相似的生物功能，还在抗高血压和降血脂等方面具有特殊作用。但由于β-香树脂醇在甘草中的积累量很少，直接提取工艺复杂、能耗高、且生产周期长，而复杂的分子结构使其化学合成也难以实现。利用微生物发酵方法生产β-香树脂醇生长周期短、过程可控，能够缓解对甘草资源的依赖，具有可观的经济效益和绿色环保的社会效益。 

β-香树脂醇经萜类共同合成途径的中间产物鲨烯，通过2,3-氧化鲨烯单氧酶和β-香树脂醇合酶催化形成。由于2,3-氧化鲨烯单氧酶在微生物细胞内的比活力很低，且其催化产物2,3-氧化鲨烯具有多个分支代谢，被认为是植物三萜生物合成途径中的关键限速酶之一。另外，在微生物中还未发现β-香树脂醇合酶，因此，异源表达β-香树脂醇合酶是实现微生物合成β-香树脂醇的必要条件。 

在微生物体系中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由于自身次生代谢途径有限，因而对外源途径的竞争或干扰较少，且酿酒酵母的代谢途径与基因组信息清楚，认为是合成植物次生代谢产物的优秀潜在宿主。通过强化2,3-氧化鲨烯单氧酶的表达和引入β-香树脂醇合酶实现酿酒酵母生产植物天然产物β-香树脂醇，将为植物天然产物的微生物高效合成提供技术支持。 

发明内容

本发明的目的是为解决β-香树脂醇在甘草中积累量低和化学法难以合成的局限，提供一种利用酿酒酵母工程菌生产β-香树脂醇的方法。 

为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种酿酒酵母工程菌的构建，从白色念珠菌CGMCC2.2086（Candida albicans）中克隆2,3-氧化鲨烯单氧酶SQE基因片段，化学合成光果甘草（Glycyrrhiza glabra）中的β-香树脂醇合酶bAS基因片段，从酿酒酵母INVSc1中分别克隆组成型启动子TYS1p、FBA1p和终止子TYS1t、FBA1t，然后通过重叠延伸PCR构建2,3-氧化鲨烯单氧酶基因表达盒TYS1p-SQE-TYS1t和β-香树脂醇合酶基因表达盒FBA1p-bAS-FBA1t，与Sal I和BamH I双酶切后的pRS41H质粒共同转入酿酒酵母INVSc1中，通过酿酒酵母自身的同源重组实现两个基因表达盒和质粒的连接，以质粒形式存在。 

本发明的酿酒酵母工程菌，为INVSc1/pRS41H-(TYS1p-SQE-TYS1t)-(FBA1p-bAS- FBA1t)，在其中强化表达了2,3-氧化鲨烯单氧酶和导入了β-香树脂醇合酶。 

本发明的酿酒酵母工程菌能够发酵生产β-香树脂醇，实现了β-香树脂醇的酿酒酵母合成。本发明的酿酒酵母工程菌，具有以下优点： 

1、本发明构建的酿酒酵母工程菌，通过酿酒酵母自身的同源重组功能实现基因表达盒和质粒的连接，与传统的限制性酶切、连接组装方法相比，不需要酶切和连接反应，基因操作容易，基因组装过程高效。 

2、2,3-氧化鲨烯单氧酶和β-香树脂醇合酶分别受组成型启动子TYS1p和FBA1p控制，β-香树脂醇的合成与酿酒酵母生长耦合，不需要效应剂的诱导，简化了发酵工艺，降低了成本。 

3、本发明的酿酒酵母工程菌代谢葡萄糖直接合成β-香树脂醇，实现了植物次生代谢产物β-香树脂醇的酿酒酵母人工合成，最高生产浓度达25.5mg/L。 

附图说明

图1是本发明实验例中酿酒酵母工程菌发酵生产β-香树脂醇的组分分析总离子色谱图； 

图2是本发明实验例中酿酒酵母工程菌发酵生产的β-香树脂醇的质谱图。 

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例1：酿酒酵母基因工程菌的构建