[发明专利]一种以酿酒酵母孢子作为新型吸附剂的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物资源和环境生物技术领域，具体地说是涉及一种以酿酒酵母孢子为原料的新型吸附剂的制备方法及其应用。

背景技术

壳聚糖是由几丁质经过脱乙酰反应得到的，其化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D-葡萄糖，其最显著的一个特性是其吸附能力，其分子中的氨基和与之相邻的羟基与许多金属离子(如Hg²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺、Ca²⁺、Ag⁺等)均能形成稳定的螯合物，因此可用于治理重金属废水、净化自来水及在湿法冶金中分离金属离子等。此外，壳聚糖能通过络合及离子交换作用，对染料、蛋白质、氨基、核酸、酶、卤酸素等进行吸附，用于染料废水、印染废水、食品工业废水的处理，从而净化环境，保护人类健康。目前已有利用壳聚糖来吸附污水中的一些金属离子(如Cu²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺等)的报道，从而减轻水污染。壳聚糖除了在环保方面的应用外，在其他方面也有很大的用途，比如控制胆固醇的合成，抑制细菌活性，控制和预防高血压以及用作保健品、食品添加剂等领域。

目前，国内工业生产壳聚糖的方法主要是以虾、蟹壳为原料，利用酸脱钙、碱脱蛋白、高锰酸钾脱色等步骤制得产品，但是由于原料虾壳或蟹壳不易收集且原料的质量不能保证稳定，时间长还存在腐败的可能性，强酸或强碱处理会造成环境的污染。而且随着人们产品需求量的加大及环保意识的加强，急需挖掘出新的壳聚糖生产方法。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有酿酒酵母孢子的制备方法及应用中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种酿酒酵母孢子的制备方法，以达到制备特定用途的酿酒酵母孢子的目的。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种酿酒酵母孢子的制备方法，包括，酿酒酵母单菌落的培养，采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母SK1孢子壁最外层二酪氨酸层DIT1基因，将得到的酿酒酵母缺陷菌株在YPAD固体培养基平板上划线，28℃～32℃培养长出酿酒酵母单菌落；酿酒酵母孢子的制备，挑取酿酒酵母单菌落到YPAD固体培养基中培养22h～26h，然后将菌液转接到YPAce培养基中，培养后收集细胞，再转到浓度为1%～3%的醋酸钾溶液中培养，使得醋酸钾溶液中细胞的浓度为2×10⁷/ml～4×10⁷/ml，而后离心，将离心后的酿酒酵母菌体用PBS缓冲液洗涤，在36℃～38℃下用一定量的lyticase处理0.5h～1.5h后，进行超声波破碎，得到游离状态的酿酒酵母孢子。

作为本发明所述酿酒酵母孢子的制备方法的一种优选方案，其中：还包括，对酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥处理。

作为本发明所述酿酒酵母孢子的制备方法的一种优选方案，其中：所述对酿酒酵母孢子进行纯化，包括，配制Percoll溶液，将处理过的细胞用0.5%TritonX-100溶液洗涤，以除去其中的裂解酶等杂质，然后将细胞悬浮在0.5%TritonX-100溶液中，配制不同梯度50%～80%不同浓度梯度的Percoll溶液；酿酒酵母孢子的纯化，将所述Percoll溶液按照从高浓度到低浓度依次加入到离心管中，最后加酿酒酵母细胞悬浮液，离心，将上层液体除去，得到纯化的酿酒酵母孢子。

作为本发明所述酿酒酵母孢子的制备方法的一种优选方案，其中：所述酿酒酵母单菌落的培养，包括，引物设计，依据酿酒酵母DIT1基因序列设计引物如下：

上游引物P1

AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAAGCTTTGTCGAGACATTAACAAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA

下游引物P2

TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGTAGACCAATGTAGCGCTCTTACTTTAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC；

PCR扩增，利用上游引物P1和下游引物P2对质粒pFA6a-His3MX6进行PCR扩增，获得含酿酒酵母DIT1基因上下游序列的敲除片段；