[发明专利]一种布鲁氏杆菌新型疫苗及其生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种布鲁氏杆菌新型疫苗及其生产方法，属于基因工程生物制药领域。。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)也称布氏杆菌，是一种由布鲁氏菌(Brucella)引起的世界范围流行的人畜共患病，严重威胁人类和多种动物的生命健康，造成巨大的经济损失。临床特点是缓慢起病，长期发热、多汗、虚弱、全身痛和关节痛，急性期症状多在3 - 6月内消退。布氏杆菌共分为牛、羊、猪、沙林鼠、绵羊和犬布氏杆菌六种。在中国发现的主要为前三种。

布氏杆菌为细小的短杆状或球杆状，不产生芽胞，革兰氏染色阴性的杆菌。布氏杆菌对热敏感，70℃10分钟即可死亡；光直射1小时死亡；在腐败病料中迅速失去活力；一般常用消毒药都能很快将其杀死。潜伏期短者两周，长者可达半年。母牛流产是本病的主要症状，流产多发生于怀孕5-7个月，产出死胎或软弱胎儿。母牛流产后常伴有胎衣不下或子宫内膜炎，阴道内继续排出红褐色恶臭液体，可持续2-3周，患病公牛常发生睾丸炎或附睾炎。人也可感染该病，表现为长期发热、多汗、关节痛、神经痛及肝、脾肿大等症状。该病严重损害人和动物的健康，OIE将其列为B类动物疫病，中国将其列为二类动物疫病。

布氏杆菌病对畜牧业和人类健康均构成严重威胁，疫苗免疫是预防和控制布氏杆菌病的主要措施。由于布氏杆菌胞内寄生的特点，只有利福平等少数的几种抗生素对其治疗有效，但这些抗生素的副作用很大，不能长期服用，因此一旦发病并转为慢性则无法根治，并能反复发作。因此，接种疫苗是预防布氏杆菌病的最有效的手段。

对布鲁氏菌疫苗的研究已经很多年。其研发策略经历了逐渐改进和完善的过程，根据不同时期研究策略侧重点不同，可以将其大致分为三个阶段。

第一阶段：传统疫苗(活苗，死苗)：在布鲁氏菌防治方面发挥了重要的作用。其中牛用S19，猪用S2，羊用M5，仍然是防治布鲁氏菌病的重要疫苗。在传统疫苗中，活苗的免疫效果虽然很好，但是对接种的动物造成一定的影响，对人也会引起感染，且易发生返祖现象。死苗虽然不会出现上述现象，但其免疫效果不好，用量大，遗传稳定性差。

第二阶段：20世纪70年代以来，迅速发展的重组DNA技术为疫苗的研究提供了新的手段。布鲁氏菌基因工程疫苗也开始发展。核酸疫苗、亚单位疫苗、基因缺失疫苗等成为科学家们的研究热点。基因工程疫苗克服了传统疫苗的易返祖，影响接种动物等不足，且其安全问题比较容易控制和处理，因此，基因工程疫苗将在防治布鲁氏病中做出重大的贡献。

第三阶段：2000年6月26日，人类基因组测序完成标志着人类进入了后基因组时代。疫苗的研究也开始改变过去从表型分析人手的思维方式，而是从全基因水平来筛选具有保护性免疫反应的候选抗原。这种以基因组为基础的疫苗发展策略，称为反疫苗学。2002年以来，羊种、牛种、猪种布鲁氏菌基因组测序相继完成，为反疫苗学研发打下了基础。布鲁氏菌蛋白质组学的研究将成为当今疫苗研究的一个热点。

现有的畜用减毒活疫苗有S19、S2、M5和RB5l等，死疫苗有牛种布鲁氏菌45／20，羊种布鲁氏菌H38等，人用活疫苗主要有19-B和104M等。但无论是何种疫苗，动物接种疫苗后， 由于人工免疫和自然感染动物所表现的临床症状相似，很难鉴别是人工免疫还是自然感染，给动物的检疫、运输、宰杀带来了困难。

现有的布氏杆菌活疫苗的生产规程方法如下:

一级菌种制备：冻干菌种开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白眎琼脂平板或其他适宜培养基上，在36~37℃培养2~3日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，36~37℃培养48~72小时，作为一级种子。在2~8℃保存，使用期应不超过1个月。

二级菌种制备：取一级菌种接种于胰蛋白眎琼脂扁平或其他适宜培养基，置36~37℃培养48~72小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于1万~ 2万ml的适宜液体培养基，置36~37℃培养48~72小时，进行纯粹检验后置2~8℃保存，使用期应不超过30天。

菌液培养：按培养基量加入适量的消泡剂，灭菌后按培养基量的1% ~ 2%接种二级菌种，在36~37℃逐渐增大通气量，培养36小时，培养过程中可根据需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总量的1%~2 %。

按现有的规程进行布氏杆菌活疫苗(A19株)生产所培养得到菌液的活菌数为800~ 1000亿/ml，需要对该菌液进行浓缩处理，存在产量低、生产成本高等问题，有待改进。

发明内容