[发明专利]一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方法

权利要求书

1.一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片包括：

A：过敏原探针：所述过敏原探针为一种单独使用或多种选择性地组合使用；每种过敏原探针为分别包被了一种过敏原提取物的荧光微球，不同种类的过敏原探针分别具有不同的荧光编码；

B：生物素标记的抗IgE检测抗体或生物素标记的抗IgG4检测抗体，分别用来检测结合到过敏原探针上的IgE抗体或IgG4抗体；当对人血清样品进行检测时，使用生物素标记的抗人IgE或抗人IgG4检测抗体；当需要对动物的血清样品进行检测时，使用生物素标记的抗该种动物IgE的检测抗体或抗该种动物相当于人IgG4的IgG亚类的检测抗体；

C：报告分子：链亲和素藻红蛋白SA-PE或链亲和素Cy3。

2.根据权利要求1所述的用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片用于对过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量检测时，还包括：D：总IgE探针：抗人IgE单克隆抗体包被的荧光微球，用于准备IgE标准曲线。

3.根据权利要求1或2所述的用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片，其特征在于，所述过敏原探针和/或总IgE探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）1a：当制备过敏原探针时，准备过敏原溶液：将过敏原提取物冻干粉完全溶解于缓冲溶液中形成过敏原溶液，并测定其蛋白质含量；所述缓冲溶液为0.05M的MES缓冲液，其pH值为5.5-6.5；或者为0.01M磷酸盐PBS缓冲液，其pH值为7.2-7.4；

1b：当制备总IgE探针时，准备抗体溶液：将抗人IgE抗体对0.01M磷酸盐缓冲液反复透析，并测定其蛋白质含量；

（2）微球活化：

－取适量羧基化微球，离心并吸弃上清；将微球重新悬浮于超纯水中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理，离心并吸弃上清；将微球悬浮于pH值为5.5-6.5，含0.05M-0.2M的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲溶液中，涡旋震荡20-30秒，经超声波分散处理后，离心并吸弃上清；

－将微球悬浮于上述MES缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，经超声波分散处理后，分别加入过量新鲜配置的50mg/mL氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐即Sulfo-NHS和过量新鲜配置的使用的50mg/mL水溶性碳二亚胺即EDC溶液；在室温下，避光孵育20-30min，每5分钟将其温和地颠倒混匀；孵育完成后离心并吸弃上清；

－将微球悬浮于上述MES缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，经超声波分散处理后，离心并吸弃上清；重复该步骤；

（3）微球包被：将活化后的微球悬浮于对应的MES缓冲液或PBS缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理；

－向微球中加入设定量的过敏原溶液或者抗体溶液，室温下避光孵育2-4h，其后离心移去上清；

－将包被后的微球悬浮于MES缓冲液或PBS缓冲液中，涡旋震荡20-30秒，超声波分散处理，离心并吸弃上清；重复该步骤；

（4）微球的封闭与保存：

－将包被好的微球悬浮并保存于含有牛血清白蛋白的贮存液中；

－每种包被与封闭好并可以在后续检测中使用的微球称为探针，探针通过血球计数板计数，使用时依据检测需求比例混合。

4.一种对过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量测量的方法，包括以下步骤：

1）以IgE标准品浓度为横坐标，对应的微球荧光强度中位值MFI为纵坐标作图，获得五参数拟合曲线，即MFI=A+(D/(1+(X/C)^B)^E)，其中MFI为微球荧光强度中位值，A、B、C、D、E为方程式参数，可通过相关软件计算得到；

2）将待测血清样品的MFI值代入方程式，就可计算得到待测IgE的含量，即X值，所用公式为X=C{[D/(MFI-A)]^(1/E)-1}^(1/B)；

3）根据上述计算得到的IgE的含量-X值和血清样品稀释倍数，计算出样品中过敏原特异性IgE抗体或总IgE抗体的浓度。

5.根据权利要求4所述的一种对过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量测量的方法其特征在于：

－使用总IgE探针和IgE标准品获得标准曲线，并使用该标准曲线计算过敏原特异性IgE抗体的含量；

－在检测反应中，总IgE探针的使用数目和每种过敏原探针的使用数目相等或为已知比例。

6.根据权利要求5所述的一种对过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量测量的方法其特征在于：每种过敏原探针和总IgE探针的使用数目均在500个-5000个之间，并且每种过敏原探针和总IgE探针的使用数目相等。