[发明专利]水仙迟季黄化病毒检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种水仙迟季黄化病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1）外侧上游引物：10μmol/L，引物序列为5’-CCACTTGAAGTCTATCACCA-3’；2）外侧下游引物：10μmol/L，引物序列为5’-CCAAACTAGCATCCTTGTGT-3’；3）内侧上游引物：10μmol/L，引物序列为5’-ATCACATACACACCACGACA-3’；4）内侧下游引物：10μmol/L，引物序列为5’-GTGTGTCTCTCCGTGTTCTC-3’；5）RT Buffer：5×；6）RNA酶抑制因子：40U/μL；7）反转录酶：200U/μL；8）dNTPs：10mmol/L；9）PCR Buffer：10×；10）Mgcl₂：25mmol/L；11）Taq DNA聚合酶：5U/μL；12）水仙迟季黄化病毒的阳性对照样品；13）不含水仙迟季黄化病毒的阴性对照样品；14）RNase-freeddH₂O。

2.利用权利要求1所述的水仙迟季黄化病毒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA 2μL、浓度为10μmol/L的外侧下游引物1μL和RNase-free ddH₂O 5μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×RTBuffer 2.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs 1μL、浓度为200U/μL反转录酶0.5μL、浓度为40U/μLRNA酶抑制因子0.5μL。42℃水浴60min，70℃水浴10min后自然冷却至室温，合成cDNA；

2）第一轮PCR反应：取步骤1）合成的cDNA 3μL，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs 0.5μL、10×PCR Buffer 2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L外侧上游引物1μL、浓度为10μmol/L外侧下游引物1μL、RNase-free ddH₂O14.5μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸1min，如此共35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；

3）第二轮PCR反应：取第一轮PCR反应产物0.1μL，按每管加浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs 0.5μL、10×PCR Buffer 2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂2μL、浓度为10μmol/L内侧上游引物1μL、浓度为10μmol/L内侧下游引物1μL、RNase-free ddH₂O 17.4μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液，94℃预变性3min,然后94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；

4）PCR扩增产物电泳检测：第二轮PCR反应结束后，取产物10μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果；含有水仙迟季黄化病毒样品的电泳检测结果为在539bp处出现明亮的DNA条带。