[发明专利]小麦条锈菌17号生理小种的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中的RAPD(Random Ampiified Polymorphic DNA)分子标记转化为SCAR(Sequence Characterized Ampiified Region)分子标记技术，设计了可用于监测和鉴定小麦条锈菌17号生理小种的特异性引物。 

技术背景

我国是世界上小麦种植面积最大和消费最多的国家之一，小麦的丰欠直接关乎国计民生。小麦条锈病是世界性小麦病害，全球大多数小麦产区均有发生。小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)可借助气流高空远距离传播，导致病害在不同小麦产区间流行，是影响粮食安全生产的重大生物灾害。小麦条锈病曾频繁造成包括我国在内的全球小麦主产国毁灭性的产量损失。自解放以来，小麦条锈病在我国发生过9次大流行，对小麦生产造成了灾难性的影响，特别是1950、1964、1990和2002年的四次大流行分别使小麦减产60亿kg、32亿kg、26.5亿kg和14亿kg(Chen et al.，2009)。进入本世纪以来，由于小麦条锈菌毒性变异和新小种产生，小麦条锈病已在我国小麦产区连续流行了近10年，每年损失小麦在10亿公斤左右。据统计，在美国，小麦品种对条锈病的平均抗性寿命为5-6年，在我国一个抗锈品种大面积推广后快则3-5年、慢则8-10年就“丧失”了抗锈性。抗病育种是防止小麦条锈病的一种经济有效的途径，但是由于小麦条锈菌毒性变异快，易产生新小种，小麦品种的抗病性很容易丢失。因此，研究生理小种的分布以及动态变化，可为小麦条锈病的防治提供重要的价值。 

传统的生理小种的鉴别采用鉴别寄主的方法，该方法工作量大，耗时久，且易因环境条件变化造成误判。本发明利用RAPD分子标记转化为SCAR分子标记的方法，开发的引物可用于CYR17鉴定和监测，具有准确快速、省时省力等优点。 

发明概述 

本发明是针对传统的小麦条锈菌生理小种鉴定方法的缺陷，建立一种针对于CYR17快速准确的分子鉴别方法，该方法的提出基于CYR17特异性引物的设计。 

1.CYR17的特异性引物设计 

选用小麦条锈菌CYR17、CYR33、CYR32、CYR31、CYR29、Su11-4、Su11-7、Hybird46-5共8种生理小种(型)，提取基因组DNA作为模板，用RAPD随机引物S13(TTCCCCCGCT)筛选出CYR17具有大小约为1000bp的特异性条带(如附图1所示)，对该条带进行胶回收、连接T-Vector、转化、提取质粒、测序，然后根据序列设计出CYR17号生理小种的特异性引物，上游引物5’-TTCCCCCGCTGTCT-3’，下游引物5’-GTTGAGCGGGGGAA-3’。利用该引物可以特异的从CYR17基因组DNA中扩增出一条约1000bp的条带(如附图2所示)。 

2.CYR17分子检测体系的建立 

(1)以小麦条锈菌的基因组DNA作为模板，PCR反应为25μL扩增体系，其中10×Buffer2.5μL、25mM的MgCl₂2.0μL、2.5mM的dNTP1.5μL、上下游引物各10ng、模板DNA50ng、Taq DAN聚合酶0.2U，用无菌去离子水补至25μL，混匀后，瞬时离心，放入PCR仪中进行扩增。扩增程序为：第一个循环94℃变性5min；94℃变性30sec，60℃退火1min，72℃延伸90sec，共35个循环；最后一个循环，72℃延伸7min。 

(2)PCR反应产物在2％琼脂糖凝胶中用1×TAE缓冲液电泳，电压为5-6V／cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析照相。 

(3)只有CYR17在1000bp处出现特异性条带(如附图2所示)。 

3.引物的灵敏性 

将17号生理小种的DNA分别稀释为3ng／μL，3×10^-1ng／μl，3×10^-2ng／μl，3×10^-3ng／μl，3×10^-4ng／μl，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。该方法可以检测到CYR17基因组DNA的最低浓度为30pg／μL(图3)，灵敏度高。 

附图简述