[发明专利]一种竹黄菌漆酶

说明书

技术领域

本发明一种竹黄菌漆酶，特别是一种竹黄菌漆酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列、漆酶的酶学性质以及该漆酶的应用，属于工业微生物领域。

背景技术

 漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶蛋白家族。漆酶的分布非常广，在植物，细菌和一些昆虫中都有发现，尤其在高级真菌里分布最多。在真菌中，漆酶的主要生产者有半知菌、担子菌、云芝菌、毛壳菌、侧耳菌、木霉菌等。

漆酶是一种多铜酶，可以催化氧化一系列底物，例如邻位和对位二元酚、多酚、二元胺、芳香胺、酚醛、苯硫酚、酚酸和其他的衍生物等，利用一电子氧化机制把分子氧还原成水。如果存在合适的氧化还原介质，漆酶可以氧化的底物范围还会有很大的增加。由于广泛的底物特异性，漆酶可以用于药物分析，酒的澄清，纸浆漂白、合成染料脱色、污水的生物治理、生物传感器以及化学合成，还有报道指出漆酶还可以抑制HIV-1病毒的逆转录酶。同时漆酶的催化特性也得到了很多领域的关注，主要涉及生物燃料电池的氧阴极、免疫标签以及生物催化的有机合成等方面。漆酶已成为一种重要的、与工业相关的酶，越来越受到人们的重视。

竹黄(Shiraia bambusicola p. Henn.)又名天竹花、竹三七、赤团子等，是我国一种传统的药用真菌，隶属于子囊菌亚门，核菌纲，球壳目，肉座菌科，竹黄属。特异寄生于某些竹子的嫩枝上，其子实体称为竹黄。竹黄是一种民间药材，常用其泡酒，治疗坐骨神经痛、风湿性关节炎、跌打损伤、虚寒胃痛、气管炎和小儿惊风等症。前期我们发明了“一种竹黄菌发酵生产漆酶的方法（ZL 201010501212.X）”，本发明进一步阐明了该漆酶的性质及用途。

发明内容

本发明目的是提供一种竹黄菌漆酶，进一步阐明了该漆酶的性质及用途。

本发明的技术方案：一种竹黄菌漆酶，其相关蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

该竹黄菌漆酶对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

该竹黄菌漆酶的分子量按MALDI/TOF-MS所确定的为70.78 kDa。

其反应温度为20-65℃相对酶活大于50%，反应温度为50℃时相对酶活接近100%，及温度稳定性为40-50℃。

其反应pH及pH稳定性：以DMP、愈创木酚、丁香醛连氮或ABTS为底物其反应pH值分别为4-5、5.5、6或3-4；以DMP为底物时，将漆酶分别置于pH值为3-9的缓冲液中处理96小时测定剩余酶活，pH值在6-7时酶活比较稳定，pH值低于5或高于8时剩余酶活不足起始的50%。

金属离子对其作用：金属离子Fe²⁺,Ag⁺及Fe³⁺对其作用10分钟后，酶活损失较大，剩余酶活分别为0%，8.13%及67.50%。

酶抑制剂对其作用：酶抑制剂SDS及NaN₃对其作用10分钟的剩余酶活分别为10.22%及7.86%，其它抑制剂NaF、DTT、L-cys、EDTA及EGTA相对来说对其抑制作用较弱。

所述的竹黄菌漆酶的应用，在工业染料脱色方面的应用，对蒽醌类色素200mg/L的AB129，具有很强的脱色能力，反应2小时，脱色率达到66.60%；而处理偶氮类色素20mg/L的AR1及50mg/L的RB5时需要小分子介体HOBT终浓度2μM的加入，2小时脱色率分别为26.50%及26.55%。

所述的竹黄菌漆酶的应用，在氨基酸转化方面的应用，催化邻苯二酚与赖氨酸相结合，形成新的赖氨酸衍生物。

1、生产菌株

本发明生产漆酶的菌株为竹黄菌株Shiraia sp. SUPER-H168，保藏号为CCTCC M 207104，已在ZL 200710132510.4中公开。

2、漆酶纯化

根据专利ZL 201010501212.X的方法发酵得到发酵液离心得到粗酶液，粗酶液进一步利用阳离子柱进行层析，纯化倍数为2.12，酶的回收率为24.16%，去除了大部分的杂质。阳离子交换层析后收集到的酶液利用分子筛凝胶层析纯化倍数为2.14，酶的回收率为12.98%，得到了纯漆酶。

3、漆酶分子量

将步骤2得到的纯漆酶通过MALDI/TOF-MS技术测得其分子量为70.78 kDa。

4、漆酶的最适温度及温度稳定性