[发明专利]一株邻苯二甲酸酯高效降解芽孢杆菌的筛选鉴定及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高效降解邻苯二甲酸酯芽孢杆菌的筛选鉴定及其应用。 

背景技术

邻苯二甲酸酯（Phthalates,PAEs,酚酞酯）是世界上生产量大、应用面广的人工合成有机化合物之一，属芳香族二羧酸酯,多为高沸点、低蒸气压、无色无味的液体，它们被广泛应用于塑料助剂、油漆溶剂、合成橡胶和涂料等的增塑剂和软化剂，以增大塑料的可塑性和韧性,提高塑料的强度。PAEs类化合物是大约30种化合物的总称，由邻苯二甲酸和相应的醇化合而成的，我国常用的品种有：邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）、邻苯二甲酸二辛酯（DOP）、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)等，其中DBP和DEHP用量最大，DBP和DEHP被美国环保局列为优先控制污染物，欧盟也将DBP作为高风险评估的管控物质，中国也已经将其列入环境优先污染物黑名单。 

近年来，随着邻苯二甲酸酯（Phthalates,PAEs）在工业中的大量使用，PAEs已经普遍存在于土壤、底泥、水体、空气以及大气沉降物等环境中，成为环境中重要的污染物之一。目前普遍认为PAEs是一种环境内分泌干扰物，而其中的某些种类对人体和动物具有致畸、致癌、致突变作用，邻苯二甲酸酯类可通过消化系统、呼吸系统及皮肤接触等途径进入人体，具有生殖毒性和发育毒性，这种危害是隐蔽而漫长的。 

邻苯二甲酸酯在环境中半衰期长，其水解和光解的速率非常缓慢，属难降解物质, PAEs的微生物降解是自然环境中的主要途径,目前仅见余志晟等报道的Gordonia sp.QH-9 可降解邻苯二甲酸酯的专利。曾巧云等研究了PAEs可通过土壤及自身的挥发进入农作物，且在农作物内具有富集特性，经食用进入人体，直接危害人体健康。由于芽孢杆菌能形成芽孢，在自然环境中的抵抗力强于其他微生物，因此,获得PAEs高效降解菌尤其是高效降解芽孢杆菌具有重要的实践意义，可为消除环境PAEs污染、保护生态环境和保障农产品安全提供菌种资源和技术支撑。 

本专利是从四川省雅安市雨城区使用地膜的蔬菜田地的土壤中分离到的一株可高效降解邻苯二甲酸二丁酯的菌株，经16S rDNA测序鉴定，该菌株基因序列与Bacillus subtilis菌株序列高度同源。经过试验可知该菌株可利用邻苯二甲酸二丁酯作为唯一碳源和能源生长繁殖，在14h内可将LB培养基中200mg/L DBP完全降解，且在宽温度（30℃-45℃）和宽pH（pH5.0-8.0）范围内均对邻苯二甲酸二丁酯均有较好的降解能力；同时，该菌对邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸丁苄酯、邻苯二甲酸二壬酯等均具有较强的降解能力。充分说明该菌株在处理含有邻苯二甲酸酯类化合物污染的生物修复方面具有独特的应用潜力。 

发明内容

本发明的目的是提供一株可高效降解邻苯二甲酸酯类化合物的菌株及其应用。 

本发明所提供的降解菌株经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.7950，保藏日期为2013年07月22日。 

本发明所提供的降解菌株Bacillus subtilis strain JF的生物学特性：兼性厌氧，革兰氏染色阳性的芽孢杆菌，对葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇发酵均呈阳性；能水解明胶和淀粉；苯丙胺酸脱氢酶和卵黄卵磷脂酶呈阴性。 

本发明所提供的降解菌株的分离与筛选： 

取四川省雅安市雨城区使用地膜的蔬菜田地的土壤样品4份，分别拌匀，各取5g，置于装有30mL LB培养基的250 mL锥形瓶中，于80℃下加热10min，冷至室温再加入邻苯二甲酸二丁酯使其质量浓度为50 mg/L，于35℃、180 r/min振荡培养168h。培养结束后按5%接种量再依次进行3次富集培养，每次培养168 h，并逐步提高培养基中邻苯二甲酸二丁酯浓度，使之分别达到100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L。将最后一级梯度驯化后的培养液按5%（v/v）接种量转接于30 mL 含100 mg/L邻苯二甲酸二丁酯的LB培养基中，并用无菌生理盐水作空白对照，于35℃、180 r/min振荡培养120 h，测定各培养液中邻苯二甲酸二丁酯残留量。