[发明专利]一种党参愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法

权利要求书

1.一种党参愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞培养、水杨酸调控党参悬浮细胞中多糖的含量，其主要步骤如下：

（1）按照植物组织培养常规消毒方法对野外采取的党参外植体材料进行消毒处理，获得无菌的外植体；

（2）将步骤（1）获得的无菌党参叶片，芽接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，诱导出来的愈伤组织继代培养4-5代，获得嫩绿松散的愈伤组织；

（3）将步骤（2）获得的嫩绿松散的愈伤组织用镊子夹取接种在附加激素0.2-1 mg/L IAA和0.5-2 mg/L KT的B₅培养基中进行震荡悬浮培养，形成稳定的细胞系；

（4）将步骤（3）获得的党参悬浮细胞接种入B₅+0.5mg/LIAA+2mg/LKT+水杨酸1-3mg/L，收集党参悬浮细胞称重，然后分两份，一份-70℃冰箱保存鲜样测酶的活性，一份60℃烘干保存干样，对党参多糖进行提取，检测。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述无菌的党参外植体叶片和芽按照下述方法得到：取党参叶片和芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗1小时，经酒精消毒处理20s，氯化汞消毒处理10分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分。

3.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：所述的培养条件为温度23℃，湿度40%～60%，光强度1000lx；光期12 h暗期12h。

4.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（2）所述的党参愈伤组织按照按照下述方法得到：将获得的无菌党参叶片和芽切成1cm²小块，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，每瓶接种3块，附加激素0.5mg/LNAA， 3mg/LIBA，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH=8，初代培养30天，连续继代4-5次，继代周期20天，获得嫩绿松散的愈伤组织。

5.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（3）所述的党参悬浮细胞按照按照下述方法得到：取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，用镊子夹取接种在附加激素0.2-1 mg/L IAA和0.5-2 mg/L KT的B₅培养基中进行震荡悬浮培养，每100mL的三角瓶中加入液体培养基50mL，摇床转速为120r/min，温度为25℃，黑暗培养，每隔7d继代一次，连续培养4-5代后逐渐形成稳定的细胞系，完成悬浮培养系的诱导。

6.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）所述水杨酸对黄芪悬浮细胞的调控按照下述方法实施：将1-3mg/l水杨酸溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，30天后取样测定党参多糖的含量，精密称取干样品1g，用洁净研钵小心研碎，转入200 mL容量瓶中，加入50 mL甲醇 （100%），于超声波液体振荡器上振荡45 min，温度60℃，过滤分离，收集滤液，最后用100%甲醇细心洗下，合并各次洗液于25 mL棕色容量瓶中。

7.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）中所述的多糖提取采用的是40%甲醇提取。

8.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于：步骤（4）中所述的多糖的检测采用的是蒽酮-硫酸法。