[发明专利]扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法。 

背景技术

灿烂弧菌（Vibrio splendidus）广泛存在于海洋环境中，是引起水产动物感染致病的主要病原菌，能引起水产贝类动物的组织溃烂、发育异常和幼苗的大批死亡，危害十分巨大。已有的研究表明，胞外金属蛋白酶（Metalloprotease）是灿烂弧菌危害水产动物的主要致病因子即感染致病的根源。该金属蛋白酶基因位于灿烂弧菌基因组的1号染色体上属于单拷贝基因，这一特点便于进行定量分析。 

目前，针对灿烂弧菌的检测方法主要包括生理生化检测方法、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、rRNA基因探针杂交技术和PCR检测技术等。但这些方法存在较多的缺点和不足：生理生化检测十分耗时耗力、结果不稳定；荧光抗体技术需要较昂贵的仪器设备；酶联免疫吸附实验灵敏度不高，且易受干扰；rRNA基因在物种中非常保守，使得技术特异性不强；普通PCR方法难以达到定量分析的要求。与以上技术相比，荧光定量PCR技术在检测灵敏度和定量分析手段上都有着传统方法无法比拟的优势。 

发明内容

本发明目的在于提供一种扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法。 

为实现上述目的本发明采用的技术方案为： 

一种扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法，以待检测的过滤海水样品中细菌基因组总DNA为模版，利用细菌16SrDNA保守区域和致病性灿烂弧菌金属蛋白酶基因的特异性的引物进行荧光定量PCR扩增和定量分析检测养殖环境中扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus；其中所述的引物为： 

16S rDNA： 

上游引物16Srtf：5’-AGAACCTTACCTACTCTTGACATCC-3’， 

下游引物16Srtr：5’-CCCAACATTTCACAACACGA-3’； 

金属蛋白酶基因： 

上游引物spf1：5’-ATGGCACAAGGGATCAGCGG-3’， 

下游引物spf2：5’-GGATAAGAGGAAGCGATAAAGAA-3’。 

所述荧光定量PCR快速检测反应体系为反应总体积为10微升，包括基因组DNA 1-4微升，SYBR Premix Ex Taq3.5微升,ROX Reference Dye 0.2 微升，引物各0.15微升（浓度10微摩尔/升），最后加灭菌去离子水至10微升。 

所述PCR反应条件为95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火/延伸30秒，收集SYBR Green荧光，40个循环。 

以待测养殖环境中的DNA样品作为模板，分别利用16SrDNA和金属蛋白酶的荧光定量PCR引物，在同一体系下进行扩增，扩增结果用2^-T分别计算出16SrDNA和金属蛋白酶浓度的相对值C_16S和C_spf；而后再利用根据所得结果得出金属蛋白酶基因在环境样品DNA中所占16SrDNA基因的比例V=C_spf/C_16S；最后利用16SrDNA标准曲线计算出的16SrDNA基因的绝对拷贝数N_16S，根据上述结果计算出金属蛋白酶的相对拷贝数M_spf=N_16S×V。 

所述16SrDNA标准曲线： 

1）利用引物16Srtf和16Srtr，通过PCR反应从待测养殖环境DNA样品中扩增细菌总的16S rDNA，根据PCR纯化产物的浓度计算16S rDNA的拷贝数； 

2）根据上述计算得出的拷贝数，用无菌水将16S rDNA稀释成不同数量级的拷贝数；根据上述拷贝数梯度，利用16Srtf和16Srtr进行SYBR Green荧光染料法荧光定量PCR反应，根据荧光定量PCR的结果绘制16S rDNA的标准曲线。 

本发明提供了扩增灿烂弧菌金属蛋白酶的特异性引物，从而提供了一种快速检测致病性灿烂弧菌的方法，同已有的检测技术相比具有如下优势： 

快速性：没有后处理，不用电泳、拍照，实施缩短反应时间；