[发明专利]一种潮霉素选择标记载体及应用该载体培育抗纹枯病的水稻的方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种重寄生真菌粉红聚端孢(Trichothecium.roseum)几丁质酶基因sdtrchi1的DNA片段的分离克隆，利用强启动子驱动的转基因技术，将重组表达载体pU1301/sdtrchi1通过农杆菌介导法转化水稻中花11号品种。该重组表达载体由几丁质酶基因sdtrchi1插入到含潮霉素抗性筛选标记的pU1301载体的BamHⅠ位点得到。本发明获得的水稻对纹枯病的抗性得到明显提高。 

（二）背景技术

几丁质酶是一种催化几丁质水解生成N-乙酰葡糖胺反应的酶，几丁质是构成大多数真菌细胞壁的主要成分。重寄生真菌产生的几丁质酶不仅可以抑制真菌菌丝生长、孢子萌发、芽管伸长，降解成熟菌丝顶端，还能降解由几丁质组成的真菌细胞壁。菌寄生真菌几丁质酶作为重要的生防资源，有巨大的应用价值。几丁质酶被认为在植物抗病性尤其是抗真菌性病害中起着重要作用^[4]。将外源几丁质酶基因导入植物是抗真菌病害育种的有效手段，可以显著提高抗病性。 

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米作为主食。水稻纹枯病是水稻生产上普遍发生的一种世界性真菌病害，由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起，是水稻的三大病害之一。长期以来，水稻没有较好的纹枯病抗源，用常规育种方法获得抗纹枯病的水稻品种可能性较小。转基因技术的发展为水稻品种改良提供了新途径。 

（三）发明内容

本发明以粉红聚端孢(Trichothecium.roseum)为材料获得一种几丁质酶基因，命名为sdTrchi1，全长cDNA为1529bp，包含一个含有信号肽的由1278bp构 成的开放阅读框，编码425个氨基酸。 

构建重组表达质粒载体pU1301/sdtrchi1，利用电击法转化农杆菌EHA105，在含有Kan+Rif/Str的YEP培养基上培养，经过PCR鉴定筛选阳性转化子。获得工程菌株pU1301/sdtrchi1-SD。利用农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，获得的转基因水稻对水稻纹枯病的抗性提高。 

（四）附图说明

图1植物表达载体pU1301/sdtrchi1重组质粒图谱 

图2T₀部分再生植株PCR产物电泳图谱 

泳道M：Marker-DL5000 

泳道1-7：T₀部分转化植株 

泳道WT：野生型植株 

图3T₀转基因植株RT-PCR检测 

泳道M：Marker-DL2000 

泳道T-2、T-3、T-14、T-15：转基因阳性植株cDNA为模板 

泳道WT：野生型植株cDNA为模板 

图4转基因阳性植株与野生型对照植株的几丁质酶活对比 

图5转基因阳性植株与野生型对照植株抗病性对比 

图6水稻纹枯病抗性检测 

（五）具体实施方式

实施例1：几丁质酶基因sdTrchi1的克隆 

（1）粉红聚端孢总RNA的提取：取几丁质酶诱导培养基上的菌丝，参照Trizol试剂盒说明。 

（2）cDNA第一条链的合成：按照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0试剂盒说明书进行：取1～2μg总RNA，加RNase Free ddH₂O至9.5μL，将RNA样品在75℃变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分：10mmol/L dNTP Mixture2μL，10×RT Buffer(Mg²⁺)2μL，25mmol/L MgCl₂4μL，Oligo d(T)-Adaptor Primer1μL，RNase Inhibiter0.5μL，AMV Reverse Transcriptase 1μL（Final Volume 20μL），将反应液混合后，室温下放10min，然后42℃温育60min，再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180μL DEPC处理的ddH₂O，稀释至200μL，混匀，稍微离心，保存于-20℃，备用。