[发明专利]制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法，本发明还涉及制备用于移植治疗范可尼贫血症的造血干细胞、间充质干细胞或神经干细胞的方法，另外，本发明还提供用于治疗范可尼贫血症的小分子化合物。

背景技术

范可尼贫血症(Fanconi Anemia，FA)属于先天再生障碍性贫血，是一种严重的常染色体隐性遗传疾病，其致病突变基因携带率约为1/180～1/300，发病率约为10～50/10万，其临床特征性表现为进行性骨髓衰竭，多发性先天畸形以及恶性肿瘤易患性等重大致死性症状。FA在世界各人群中均有发现，在某些种族人群中发病率异常增高，例如德系犹太人和荷裔南非人中的FA基因携带率为1/90，而西班牙吉普赛人中的FA基因携带率高达1/64～1/70。近年来随着对FA临床表现和发病机理的深入了解，我国FA患者的检出率逐年增高，尤其是3-14岁儿童病例屡见报道，由于FA致残致死率极高，同时尚无便捷有效的治疗手段，给患儿及其家庭带来巨大的痛苦和经济负担，因此急需针对FA建立有效的诊断和治疗技术，以及高效的药物筛选平台。

目前已发现15个FA相关致病突变基因(分别为FANCA、B、C、D1、D2、E、F、G、I、J、L、M、N、O和P)，并且所有FA相关基因都参与一个重要的DNA修复途径(FA/BRCA途径)。已有研究表明，通过在FA/BRCA通路缺陷的细胞内过表达相应的正常FA基因，可以纠正基因缺陷，恢复细胞正常的生理功能，提示了未来可以通过基因治疗来治愈FA。然而，目前造血干细胞移植是临床治疗FA的唯一手段，但同时造血干细胞的来源以及免疫排斥反应限制了该治疗手段的临床应用。近年来，诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)技术的出现和发展为疾病的药物筛选、基因治疗和细胞治疗提供了广阔前景。iPSC是通过将特定转录因子(如OCT4，SOX2，KLF4，cMYC等)导入体细胞，使其转变成为的具备胚胎干细胞特性的细胞，进一步定向分化为疾病累及细胞类型，为该类疾病药物筛选提供具有显著优势的基于人类细胞的药物筛选平台。事实上,许多公司已经开始致力于建立iPSC疾病模型用于药物发现研究。罗氏(Roche)与欧洲创新药物计划(IMI)2012年联合宣布推出StemBANCC，旨在以人诱导多能干细胞为研究工具，开发人类疾病模型，促进药物开发，该计划研究包括糖尿病和老年痴呆症在内的一系列疾病。此外，Cellular Dynamics和AstraZeneca公司也宣布将合作开发人类iPSC体外疾病模型，特别的是利用MyCell技术将特定病人的细胞转化为体外疾病模型进行药物筛选。这种突破性的新技术将为人类疾病机理研究和药物筛选实现新的跨越。另外，iPSC并非源于胚胎组织，不会受到伦理问题的限制，结合现有的基因打靶技术对患者自体来源的iPSC进行基因突变的基因组原位矫正，在基因水平清除内源性致病因素，为血液病的移植细胞治疗提供良好的移植材料，在个性化治疗和转化医学中巨大的应用前景。

针对FA，目前可用雄激素，糖皮质激素和造血生长因子进行治疗，但是只能改善症状，疗效难以持续，更无法根除。其原因在于目前范可尼病的疾病模型和药物筛选平台不能满足进行药物筛选的需求。利用iPSC这一前沿技术，对范可尼病人体细胞进行重编程，并定向分化为范可尼疾病累积的细胞类型，可建立新型范可尼药物筛选平台。另外，通过IPSC技术平台，利用基因打靶技术对患者自体iPSC中的致病基因突变进行基因矫正，再将其定向分化为无致病突变的正常造血干细胞，继而用于治疗血液系统疾病。因此，建立高效的范可尼患者体细胞重编程体系至关重要。然而与其他遗传性贫血症相比，范可尼贫血症患者的体细胞重编程研究具有更大的困难和挑战性。已有研究表明，FA涉及的FANC/BRCA信号通路在发育和DNA损伤修复中发挥至关重要的作用，患者体细胞本身存在DNA损伤和不稳定性，而重编程过程中又会进一步引发活性氧(ROS)增加、DNA断裂和细胞死亡(Senescence)等细胞事件严重阻碍体细胞重编程的过程，因此针对FA患者携带致病突变细胞的体细胞重编程研究困难重重，国内外鲜见成功实施的案例。