[发明专利]一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌及其制备方法和应用。

背景技术

米尔贝霉素属于十六元环大环内酯类抗生素，与阿维菌素具有相似的结构。米尔贝霉素最初由日本科学家从土壤放线菌Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus的发酵液中分离得到，比目前使用最广泛的生物农药阿维菌素杀螨活性略高，而对大鼠的毒性比阿维菌素低40倍。因此，米尔贝霉素被美国环保署认定为危险性小的杀虫剂，被荷兰批准成为“GNO”（作物生产中的天然产物），属于生态友好型农药，适用于有机农业害虫综合防治，被认为是当今世界上最优良的杀螨剂。米尔贝霉素已在美国、日本等43个国家和地区登记，用于苹果、柑橘、草莓、茶叶等24种植物上对阿维菌素、有机磷农药产生抗性的螨、斑潜蝇、蚜虫、粉虱的防治。在米尔贝霉素系列药物中，米尔贝霉素A3/A4具有较强的杀虫活性。因此，目前米尔贝霉素产品的商业化大多围绕米尔贝霉素A3/A4而进行。除Milbemectin（米尔贝霉素A3和A4的混合物）被用于杀螨剂外，米尔贝霉素A3/A4的肟化物Milbemycin oxime也已商品化用于兽药，可有效预防犬心丝虫症及驱除肠道内的寄生虫（蛔虫、钩虫和鞭虫）。

冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis是本实验室从土壤中分离得到的米尔贝霉素产生菌。与其它米尔贝霉素产生菌Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus和Streptomyces griseochromogenes一样，冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis除了产生米尔贝霉素A3/A4外，还产生其它米尔贝霉素系列化合物及其它的次级代谢产物。通过对Streptomyces bingchenggensis进行选育，我们获得了一株米尔贝霉素A3/A4高产菌株Streptomyces bingchenggensis BC-109-6（Xiang-Jing Wang,Xiao-Chong Wang,Wen-Sheng Xiang.Improvement of milbemycin-producing Streptomyces bingchenggensis by rational screening of ultraviolet-and chemically induced mutants[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25:1051-1056）。虽然Streptomyces bingchenggensis BC-109-6中米尔贝霉素A3/A4的产量有了明显的提高，但其还产生杂质化合物C5-O-甲基米尔贝霉素B2、B3、β1和β2以及南昌霉素。这些杂质化合物的生物合成一方面会降低米尔贝霉素A3/A4的产量，另一方面会严重影响米尔贝霉素A3/A4的分离纯化。目前，冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis的全基因组测序已经完成，米尔贝霉素和南昌霉素的生物合成机制也已被阐明（Xiang-Jing Wang,Yi-Jun Yan,Bo Zhang,et al.Genome sequence of the milbemycin-producing bacteriumStreptomyces bingchenggensis[J].Journal of Bacteriology,2010,192:4526-4527）。因此，通过基因工程手段改造冰城链霉菌以提高米尔贝霉素A3/A4的产量和阻断其它杂质的生物合成对于提高产值、降低生产成本具有重要的意义。

发明内容

本发明提供一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌BCJ36，是以冰城链霉菌BC-109-6为出发菌株，进行milD基因和nanLD基因的阻断，构建冰城链霉菌的基因阻断突变菌。