[发明专利]导入SV40LT和hTERT重组基因构建神经管缺陷细胞模型及其细胞库

说明书

技术领域

本发明涉及导入SV40LT(猴肾病毒40大T抗原基因)和hTERT(端粒酶逆转录酶催化亚基)重组基因(SV40LT和hTERT介导)构建神经管缺陷细胞模型及其细胞库的方法，主要用于出生缺陷干预研究领域，为神经管缺陷的体外研究提供细胞模型并保存其科研资源。

背景技术

神经管缺陷又名神经管畸形，是一种常见而严重的先天缺陷。神经管是胎儿的中枢神经系统，在胚胎的第15-17日开始，神经系统开始发育，至胚胎22日左右，神经褶的两侧开始互相靠拢，形成1个管道，称为神经管，它的前端称为神经管前孔，尾端称为神经管后孔，胚胎在24-25日及26日时，前孔及后孔相继关闭。胎儿神经管畸形主要表现为无脑儿、脑膨出、脑脊髓膜膨出、隐性脊柱裂、唇裂及腭裂、开放性脊柱裂、闭合性脊柱裂等。

有研究表明，人类大脑是在神经管上发育而形成的，如在妊娠3-4周起至4个月，孕妇缺乏叶酸，便可能导致胎儿出现不同程度的神经系统先天性畸形。许多种类基因的表达或突变与神经系统发育、神经管畸形有关，这些基因是转录因子，包括①发育调节基因及转录因子类基因。②原癌基因和抑癌基因。③生长因子及其受体基因。④蛋白激酶C相关基因。⑤同型半胱氨酸代谢相关基因。⑥其他基因：细胞骨架类、细胞连接类基因等。神经管畸形发生的重要因素是妊娠期间孕妇体内缺乏叶酸，因此孕妇在孕前1个月至孕后4个月内，每日口服1次叶酸0.4毫克，就可使胎儿神经管畸形发生率降低70％。尽管如此，神经管畸形的发病机制、如何更好地预防、干预或治疗，还有待于更进一步的研究。

但是，由于没有理想的可在体外长期培养的、可用于发病机制研究的永生细胞模型及其细胞库，就难以从细胞水平在体外研究神经管缺陷细胞受物理、化学、生物、遗传等影响的基因突变、基因表达、功能改变、生理特性、生物传导等机制，从而严重限制了神经管缺陷的进一步研究。

国外文献报道，猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。

但国外最近有研究发现，SV40Tag转染的细胞伴随着DNA损伤修复机制的丢失、核型的不稳定性以及少数细胞致瘤性转化。此外，长期体外培养发现部分转染SV40Tag的细胞只是延长了寿命，或仅仅渡过了衰老期(MI期)，多数细胞会最终进入危机期(M2期)而死亡，说明细胞并未获得永生化。同时SV40病毒具有致瘤性，与某些肿瘤的发生、发展有关，因此SV40Tag转染的细胞对某些研究也存在一定程度的限制性。

国外研究表明，导入外源性hTERT可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来已利用hTERT成功建立了某些细胞的永生化细胞系，基本保持染色体稳定、分化正常、接触抑制、无致瘤性等相对“正常”的生长特征。可以用于人类和动物某些种类的细胞模型的建立，对借助于研究转基因永生化细胞模型而研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制，具有重要的意义。在口腔医学领域，日本学者Kamata、Fujita和Fujii转染hTERT建立了永生化人牙龈成纤维细胞、牙周细胞、牙髓细胞系和牙囊细胞系，细胞群体倍增数达150次以上，细胞均表现原有的生物学特性，诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa等转染hTERT建立了人成牙骨质细胞系，细胞倍增达200次以上，细胞分化标志物如碱性磷酸酶、I型胶原等表达稳定。因研究工作的需要，几乎每种疾病都有各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。