[发明专利]利用湖羊生产抗ApoB多抗血清的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗原生产方法，具体涉及一种利用湖羊生产抗ApoB多抗血清的方法及其使用方法。

背景技术

载脂蛋白B(ApoB) 在脂蛋白代谢中具有重要的生理功能, 是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-CHOL）的主要结构蛋白,也是生物试剂的重要原料，现有的生产方法采用传统的免疫方式，产量与效价较低，已无法满足日益增长的使用需求。

发明内容

发明目的：为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种可提高产量与效价的利用湖羊生产抗ApoB多抗血清的方法。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供的利用湖羊生产抗ApoB多抗血清的方法包括以下步骤：

1）免疫原乳剂的制备，将含有ApoB抗原25mg的血清0.1ml，无菌PBS1.9ml，弗氏佐剂2ml混合并乳化，得到免疫原乳剂；

2）湖羊免疫第一针，在湖羊的前后腹股沟，每腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，皮下注射，足底部2个注射点平均注射；

3）与步骤2）间隔十天注射第二针，前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，后腹股沟淋巴结左右2个注射点；

4）与步骤3）间隔十天注射第三针，前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；

5）与步骤4）间隔十天注射第四针，前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；

6）与步骤5）间隔十天对免疫的湖羊动脉采血，血液放入水箱中1小时温度40oC，待血清充分析出，经离心沉淀分离出抗血清，放进冰箱保存温度在4oC—8oC之间；

7）对步骤6）所得抗血清进行效价测定。

作为优选，所述步骤2）中注射的免疫原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏完全佐剂。

作为优选，所述步骤3）、4）、5）中注射的免疫原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏不完全佐剂。

作为优选，所述步骤7）的效价测定采用的方法为琼扩方法。

有益效果：本发明将ApoB抗原经皮下注入湖羊腹股沟外并进行多次加强免疫，使其产生高效羊抗ApoB抗体可达1:512以上。为生物试剂厂提供原料、为医疗诊断提供方便，使湖羊产生了高的效益。

具体实施方式

实施例：实验动物选用湖羊公羊25只，体重35公斤左右健康羊，免疫前全部打上耳标，羊群采用圈养，结合放养，保持正常体况，避免羊只过肥，提高免疫力，自动饮水器，每天牧草供给，适量添加精料、醋糟、麸皮和维生素等。

人的ApoB接种0.1ml（合抗原25mg）1.9ml无菌PBS完全弗氏（或不完全）佐剂2ml制成免疫原乳剂备用。

湖羊免疫第一针，前后腹股沟，每腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，皮下下注射，颈部两侧2个注射点平均注射。

第二针，间隔十天，前后腹股沟分2个点注射，总共12个注射点，后腹股沟淋巴结左右2个点。

第三针，间隔十天，前后腹股沟分2个点注射，总共12个注射点，后腹股沟淋巴结左右2个点。

第四针，间隔十天，前后腹股沟分2个点注射，总共12个注射点，后腹股沟淋巴结左右2个点。

其中第一针即第一次免疫注射的免疫原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏完全佐剂。

其余免疫中即第二、三、四针注射的免疫原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏不完全佐剂。

十天后对免疫的湖羊动脉采血，血液放入水箱中1小时温度40oC，待血清充分析出，经离心沉淀分离出抗血清，放进冰箱保存温度在4o～C8oC之间；

采用琼扩方法对所得抗血清进行效价测定

1.配制琼脂：称取1.2g琼脂粉，加入100ml生理盐水中，水浴加热溶解后，以115℃灭菌10分钟；

灭菌结束后，取出琼脂溶液，冷却至70℃左右，用吸管吸取琼脂液，加入干净的平皿中，每块平皿16ml，待冷却后收起平皿，放于2～8℃冰箱中保存，可保存2周；

用前在平皿上用梅花打孔器打孔，中间孔加入抗原，外周孔加稀释后的待检血清。

2.样品血清稀释：取出96孔细胞培养板或血凝板，在每孔中加入25μl生理盐水或PBS；

在每行的第1列孔中加入25μl样品血清，从第1孔向后倍比稀释至第10孔。

3.加样检测：取出打好梅花孔的琼脂平皿，在外周孔中按顺序加入倍比稀释的样品血清，每孔约加20μl，以孔加满为宜；

在梅花孔的中央孔中加入上述分离出的抗血清；

将加好样的琼脂平皿放入湿盒中，置37℃过夜;

4.血清效价评定：

观察外周孔与中央孔沉淀线出现位置，计算样品血清的效价。测得第9孔有沉淀线（凝集反应）说明测定此批次抗血清的效价为1:512。