[发明专利]动物器官人源化的方法及人-动物嵌合体模型

说明书

本发明涉及一种动物器官人源化的方法，其通过使用高效的DTA作为毒性基因产物，构建DTA‑Cre双转基因动物，植入该双转基因动物体内的人体干细胞，可以发育成人的体细胞，部分或完全替代动物体内原内脏或血液，达到人体细胞部分或完全替代动物体内目标脏器或血液的效果，并且通过使用四环素调控系统调控，可以严密控制毒性DTA的表达。通过上述方法构建的人‑动物嵌合体代替传统的转基因小鼠，操作简便。此外，本发明还涉及一种使用上述动物器官人源化的方法构建得到的人‑动物嵌合体模型。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及一种动物器官人源化的方法及使用该方法构建的人-动物嵌合体模型。

背景技术

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）属于嗜肝病毒科，嗜肝病毒都有较强的种属特异性和组织特异性。例如人类乙肝病毒的自然宿主只有人类和少数非人灵长类动物（如黑猩猩），通常只侵犯宿主的肝脏组织。医学实验中最常用的实验动物小鼠因其肝脏无法感染HBV而限制了在这一研究领域的使用。而人与动物嵌合肝脏模型正好能够解决这一难题，因为这种模型动物可以在自然情况下感染HBV。除用于HBV研究，这一模型还可以精确地测量抗HBV载体的效能。除应用于HBV的研究，人和动物的嵌合肝脏还可以应用于其他很多方面，包括人类肝细胞的生产和人工肝移植等。

肝脏有一个显著的特点，即肝细胞具有增殖的潜力。在部分肝切除后，或在病毒性肝炎中发生散在的肝细胞细胞死亡时，肝细胞的增殖可以弥补肝脏细胞的损失直到肝脏回复原状。肝脏细胞群的这一生理控制机制已经被用来制造人与动物嵌合肝脏：建立一种宿主肝细胞慢性死亡机制，从而产生一个增值信号来刺激移植进来的人类肝细胞。目前已有两个动物模型建立在这种机制之上，即尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogenactivator，uPA）转基因小鼠模型和富马酰乙酰乙酸水解酶（fumaryl acetoacetatehydrolase，FAH）基因敲除小鼠模型。肝细胞中uPA通常存在低水平的表达，过量的表达将导致细胞毒性从而摧毁宿主细胞。在转基因uPA模型中，白蛋白基因启动子驱动多拷贝的uPA基因，合成致毒剂量的uPA蛋白，结果导致宿主慢性肝细胞死亡。在FAH模型中，因为敲除了络氨酸异化通路中的一个基因FAH，引起毒性代谢物尿激酶型纤溶酶逐渐累积从而导致宿主慢性肝坏死。虽然上述两个模型中一致的人肝细胞可以填补替代高达70%的宿主肝脏，但由于毒性产物累计造成子代频繁死亡而使得这两种模型难以传代。

发明内容

基于此，有必要提供一种可以较为容易传代的且可以完全替代动物器官的动物器官人源化的方法及使用该方法构建的人-动物嵌合体。

一种动物器官人源化的方法，包括如下步骤：

构建含有DTA基因的转基因动物以及含有Cre基因的转基因动物，其中，所述含有DTA基因的转基因动物的启动子与DTA基因被两个LoxP和一个停止序列隔开，由所述LoxP加上停止序列抑制表达，所述含有Cre基因的转基因动物的Cre基因的启动子由转入动物体内特异性启动子启动的四环素依赖的反式作用子启动；

将所述含有DTA基因的转基因动物与所述含有Cre基因的转基因动物杂交，并对杂交后代进行基因筛选得到含有Cre基因及DTA基因的双转基因动物；

向所述含有Cre基因及DTA基因的双转基因动物体内植入人体干细胞，制得含有人体细胞的双转基因动物；

对含有人体细胞的双转基因动物喂食或注射四环素或四环素衍生物，诱导表达Cre，从而介导两个Loxp位点的重组，移除停止序列，启动子接近并启动表达DTA基因，杀死动物体内目标细胞，促进人源性细胞的增生，得到人-动物嵌合体模型。

在其中一个实施例中，所述含有DTA基因的转基因动物为由ROSA26启动子启动表达的含有LoxP停止序列及DTA基因的动物，所述LoxP停止序列位于所述ROSA26启动子与所述DTA基因之间。