[发明专利]一种胚胎干细胞无血清培养基及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及胚胎干细胞的培养，具体地说，是一种胚胎干细胞无血清培养基及其应用。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ES Cells)是由早期胚胎内细胞团(Inner cell mass，ICM)或原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外分化抑制培养筛选出的一种全能干细胞。胚胎干细胞的形态特征与早期胚胎细胞非常相似，具有稳定的自我更新能力，长时间体外继代培养后仍能保持正常的二倍体染色体结构；同时胚胎干细胞也有非常强的分化能力，在特定的条件培养下，它可以增殖分化为全身200多种细胞类型。因此胚胎干细胞可以提供一种理想的生物学平台，用于科学研究与临床应用，如药物筛选、细胞发育与分化的分子调节机制研究、组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立、细胞治疗及再生医学等。

要想充分运用干细胞，首先要建立和维持好干细胞系。ES细胞的培养关键是既要维持细胞的未分化状态和潜能性，又要使其无限增殖。传统建立和维持人胚胎干细胞系的标准方法是：ESC生长在有丝分裂失活的饲养层细胞(FEEDER)上，基本培养基多为DMEM并添加胎牛血清(FCS)及白血病抑制因子(LIF)等。但是，这种培养系统中含有大量的动物源成份，如血清及饲养层细胞等。大量动物源成份的长期使用不仅增加了胚胎干细胞感染外源性病毒、病原体的危险性，还可能造成胚胎干细胞的污染。移植此种来源的胚胎干细胞，潜在的外源性病原体将感染患者，那些被污染的胚胎干细胞也有可能在患者体内诱发激发强烈的免疫反应，发生免疫排斥，这些潜在风险必将极大限制胚胎干细胞的临床应用。已有文献报道，饲养层细胞或血清产品培养的人类胚胎干细胞表达Neu5Gc，一种非人类的唾液酸，这种被污染的人类胚胎干细胞将有很大的可能在患者体内诱发免疫反应。同时，饲养层细胞及血清的使用还对ESC生长、增殖及分化等分子机理研究造成限制，也将给药物筛选带来干扰。另外，传统培养系统中各种复杂未知的营养成份，在长期培养过程中，也有可能会选择或改变胚胎干细胞的某些表型。因此，为了更好的利用胚胎干细胞的这一理想的生物学平台，必须优化培养系统，建立一个没有动物源物质、成份确定的人胚胎干细胞无血清培养基。并且该培养基既能维持胚胎干细胞的未分化状态和潜能性，又能使其无限增殖。

CHIR99021和XAV939均为小分子抑制剂，它们的结构分别如下：

。

小分子抑制剂CHIR99021是目前所知的糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的最选择性抑制剂。XAV939也是小分子选择性抑制剂，作用于TNKS1和TNKS2。GSK-3β、TNKS1和TNKS2都是Wnt信号通路中的重要参与者，Wnt信号通路参与调控干细胞的增殖和自我更新。目前关于含有CHIR99021和XAV939、成分明确的胚胎干细胞无血清培养基还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种胚胎干细胞无血清培养基。

本发明的再一的目的是，提供上述胚胎干细胞无血清培养基的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种胚胎干细胞无血清培养基，它包含以下组分：小分子抑制剂CHIR99021、XAV939，添加物B27/N2和基础培养基DMEM/F12，所述的添加物B27/N2的组分及各组分重量比为：

。所述的B27/N2添加物其成分明确，所含蛋白、维生素和其他成分皆来自人源重组蛋白、人源化产品或化学合成。

该培养基中，所述的小分子抑制剂CHIR99021和XAV939的摩尔比为0.8-0.95：0.95-1.08。

该培养基中，所述的基础培养基DMEM/F12的组分及各组分重量比优选为：

。但是基础培养基DMEM/F12不仅限于此，也可以直接从试剂公司购买。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：如上任一所述的胚胎干细胞无血清培养基在培养胚胎干细胞中的应用。

本发明优点在于：