[发明专利]SV40T基因诱导构建Turner综合征细胞模型及其细胞库

说明书

技术领域

本发明涉及猴肾病毒40大T抗原基因(SV40LT抗原基因或SV40T基因)介导(诱导)Turner综合征细胞模型及其细胞库的构建，主要用于医学细胞遗传学研究领域，为Turner综合征的研究提供细胞模型并保存其科研资源。

背景技术

Turner综合征表现为女性缺少一条X染色体所致的身材矮小、原发性闭经、颈蹼、肘外翻、第二特征发育不良、卵巢缺如、无生育能力等异常。部分患者智力轻度低下，或伴有心、肾、骨骼等先天畸形。本病由Turner于1938年报道，故称为Turner综合征。本病患者不可能建立生育功能。为了第二性征的发育和维持，可长期应用雌激素替代疗法，但有诱发骨质疏松、子宫内膜癌的危险，一旦出生，就会给社会、家庭和本人造成较严重的心理负担和精神痛苦，影响我国的人口质量，已成为社会可持续发展的障碍。

文献报道，本病的发生与物理、化学、生物、遗传及个体自身免疫性疾病等因素有关。但是，由于没有可在体外长期培养的、可用于本病发病机制研究的永生细胞模型及其细胞库，就难以从细胞水平在体外研究Turner综合征细胞受物理、化学、生物、遗传等影响的基因突变、基因表达、功能改变、生理特性、生物传导等机制，从而严重限制了Turner综合征的进一步研究。

国外文献报道，猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。

根据文献报道，Reilly用猿猴病毒(SV40)大T抗原基因转化来建立血管平滑肌细胞株，构建细胞模型以研究肝素对血管平滑肌的抑制作用机制。Su等利用经SV40转化的角化上皮细胞株，构建细胞模型来分析上皮细胞内蛋白质合成的调控作用。Miquel等用SV40转化的角化上皮细胞株，作为细胞模型研究层粘连蛋白5介导的细胞粘附作用。Webber等用经SV40转化的前列腺上皮细胞株作为细胞模型来研究前列腺上皮细胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用经Ad12-SV40转化肾小管上皮细胞模型来研究近曲小管的损伤和疾病。Hougton等用SV40转化建立骨髓基质细胞株作为细胞模型以研究在一定培养条件下，细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞的双向分化的潜能，进一步研究骨质疏松的机制。

因研究工作的需要，几乎每种疾病都建立了各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。

但是，至今尚未见有关构建可用于在体外从细胞水平研究Turner综合征发病机制的永生细胞模型及其细胞库的文献报道，也无法开展相关的研究项目。为了解决上述问题，本发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的目的是要提供以SV40LT抗原基因介导Turner综合征细胞模型及其细胞库的构建方法，另一目的是为在体外从细胞水平研究Turner综合征的发病机制提供SV40LT抗原基因介导Turner综合征细胞模型及其细胞库。

本发明的目的是这样实现的：以T4DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTag DNA，构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组质粒，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞以扩增、纯化并挑取耐氨苄青霉素的菌落抽提质粒，以脂质体转染法导入经胶原酶II消化的离体传代Turner综合征悬液组织细胞或在含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的培养液中处于将进入或刚进入对数生长期、梭形细胞占90％以上、汇合率达55％～65％的贴壁生长Turner综合征细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞，作传代、扩大培养，筛选细胞形态、细胞生长曲线、染色体核型、软琼脂集落生长试验、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为细胞模型冻存于液氮中，以此构建SV40LT抗原基因介导Turner综合征细胞模型及其细胞库。