[发明专利]火木层孔菌中甲基苯乙酮在抗禽流感H5N1病毒上的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗禽流感H5N1病毒的火木层孔菌中活性物质的提取制备方法，尤其涉及的火木层孔菌菌种，已于2013 年8月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”， 保藏编号为CGMCC No.8108，分类名称为火木层孔菌 Phellinus igniarius，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

背景技术

苯乙酮是一种无色晶体，或浅黄色油状液体，有山楂的气味，熔点20.5℃，沸点202.3℃，密度（20/4℃）1.0281g/cm³微溶于水，易溶于多种有机溶剂，能与蒸气一起挥发，氧化时可以生成苯甲酸；还原时可生成乙苯，完全加氢时生成乙基环己烷，用于制香皂和香烟，也用作纤维素酯和树脂等的溶剂和塑料工业生产中的增塑剂等，可由苯与乙酸酐反应制得，或由乙苯氧化制得，也可用乙酰氯与苯在三氯化铝作用下经傅氏反应制得。 

目前，抗禽流感病毒的药物种类主要集中于单克隆抗体。种类单一，有一定的局限性。 

发明内容

本发明公开了一种从药用菌中分离的具有抗禽流感活性的甲基苯乙酮。本方法较一般化合物应用的优点在于：发现了该种甲基苯乙酮的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。为抗球流感病毒提供了新的思路与方向。 

本发明的技术方案如下： 

首先制备火木层孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉    1-5%             葡萄糖      1-5%

蛋白胨     0.1-0.5%          酵母膏     0.1-0.5%

硫酸镁     0.1-0.5%          磷酸二氢钾 0.01-0.05%

(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物；

(3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；

(4)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%，乙醇优选为浓度65-95%的食用乙醇，所用体积优选为浓缩液体积的3-6倍；

(5)对步骤(4)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；

(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。

然后从火木层孔菌粗提物中甲基苯乙酮，步骤如下：火木层孔菌粗提物→正相硅胶层析→氯仿与甲醇梯度洗脱→TLC检测→正相硅胶层析→甲醇凝胶层析→TLC检测→反相硅胶层析→TLC检测→减压蒸干→5'-甲基-3'，4'-二羟基苯乙酮。 

具体方法为： 

(1)首先制备火木层孔菌菌粗提物；

(2)将上述步骤（1）所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次；

(3)收集步骤（2）中的最后一次洗脱液，减压干燥，与等体积硅胶拌样，再次进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱；

(4)收集上述步骤（3）得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；

(5)将步骤（4）得到的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇：水=10%-80%；

(6)TLC检测，适度合并洗脱液，加压干燥，即为甲基苯乙酮。

优选的，提取步骤(2)中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶，层析硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和/或甲醇； 

    提取步骤(3)中所述的硅胶用量为等体积，洗脱剂为石油醚：丙酮=20:1-40:1；