[发明专利]火木层孔菌中1,2-桉烷型倍半萜在抗禽流感H5N1病毒上的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗禽流感H5N1病毒的火木层孔菌中活性物质的提取制备方法，尤其涉及的火木层孔菌菌种，已于2013 年8月26日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，分类名称： 火木层孔菌 Phellinus igniarius，保藏编号为CGMCC No.8108。 

背景技术

   倍半萜（sesquiterpenes）是指分子中含15个碳原子的天然萜类化合物。倍半萜类化合物分布较广，在木兰目（magnoliales）、芸香目（rutales）、山茱萸目（cornales）及菊目（asterales）植物中最丰富。在植物体内常以醇、酮、内酯等等形式存在于挥发油中，是挥发油中高沸点部分的主要组成部分。多具有较强的香气和生物活性，是医药、食品、化妆品工业的重要原料。 　　 

    倍半萜类化合物较多，无论从数目上还是从结构骨架的类型上看，都是萜类化合物中最多的一支。倍半萜化合物多按其结构的碳环数分类，例如无环型、单环型、双环型、三环型和四环型。亦有按环的大小分类，如五、六、七元环，直到十一元大环都有。如按倍半萜结构的含氧基分类，则便于认识它们的理化性质和生理活性，例如倍半萜醇、醛、内酯等。 

   1,2-桉烷型倍半萜具有抗菌等多种重要的生理活性，如今，未见到有抗情流感病毒活性的报到。 

发明内容

本发明公开了一种从药用菌中分离的具有抗禽流感活性的1,2-桉烷型倍半萜。本发明首次公开了1,2-桉烷型倍半萜的一种新活性，测定了其对MDCK细胞的最大无毒浓度，证明其具有抗禽流感H5N1病毒的作用。 

本发明的技术方案如下： 

首先制备火木层孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉    1-5%             葡萄糖      1-5%

蛋白胨     0.1-0.5%          酵母膏     0.1-0.5%

硫酸镁     0.1-0.5%          磷酸二氢钾 0.01-0.05%

(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。

(3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5； 

(4)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%，乙醇优选为浓度65-95%的食用乙醇，所用体积优选为浓缩液体积的3-6倍；

(5)对步骤(4)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；

(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。

然后从火木层孔菌粗提物中制备1,2-桉烷型倍半萜，步骤如下：火木层孔菌粗提物→正相硅胶层析→氯仿与甲醇梯度洗脱→TLC检测→正相硅胶层析→氯仿甲醇凝胶层析→TLC检测→正相硅胶层析→TLC检测→减压蒸干→无色油状物（1,2-桉烷型倍半萜）。 

具体方法为： 

(1)制备火木层孔菌粗提物；

(2)将步骤（1）所得的沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，干燥后进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2-5次，得到洗脱液；

(3)将步骤（2）中最后一次洗脱液蒸干，等体积硅胶拌样，进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱；

(4)收集步骤（3）中的洗脱液，减压浓缩，使用氯仿：甲醇=1:1溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；

(5)将步骤（4）中得到的产物进行再次进行正相硅胶层析,使用洗脱剂洗脱；