[发明专利]四色荧光标记可逆终端及其在DNA测序中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一类四色荧光标记可逆终端及其在DNA测序中的用途。

背景技术

DNA测序技术是现代生命科学和医学研究的重要手段之一。DNA测序从1977年的Sanger测序技术(一代测序)开始，在三十几年的时间里，飞速发展。测序的通量大幅提高而成本急剧下降，有人甚至认为其发展的速度打破了半导体工业界已有的摩尔定律预算的速度。二代高通量平行测序技术的出现是测序技术飞速发展的集中体现。采用第一代测序技术，人类基因组计划(HGP)耗资30亿美元完成人整个基因组(30亿个碱基)的序列测定。而目前的二代测序的最新技术仅需5000美元左右就能完成人整个基因组测序。

虽然如此，二代测序的成本和技术方面依然存在不足，不能满足基础科学和临床医学对测序的要求。单分子测序技术(三代测序技术)应运而生。三代测序技术的核心是直接对单个DNA分子进行测序，不做任何的DNA扩增反应，从而减少成本，提高通量。单分子测序技术虽然已有商业化产品，但是都还存在技术上的难点，未能大规模应用。

目前市场上的高通量测序平台被少数几家国外产品所垄断，尤其令人忧虑的是，国外公司凭借对测序试剂的控制，几乎完全控制了国内的测序市场，即便是测序硬件上我们能有所突破，在测序试剂等配套产品上我们还将受制于人。因此，自主研发可适用于二代测序甚至是三代测序平台的测序试剂，将对改变目前的市场格局、建立我国自主的测序平台具有战略性的意义。为此，国家863、973和“十二五”生物技术发展规划都将研发新一代测序技术及配套产品的研发列为重点发展的对象。

发明内容

本发明的目的在于提供一类四色荧光标记可逆终端及其在DNA测序中的用途；该可逆终端具有氧化还原敏感特性。本发明是在已有工作的基础上，通过多学科交叉，首先合成了新型四色荧光标记核苷酸，并发展基于该新型核苷酸的DNA延伸反应，实现单个荧光分子超灵敏光学检测技术并最终实现具有单分子测序能力的三代测序技术原型机。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种四色荧光标记可逆终端，其结构式如式(I)所示：

其中，R₁为三磷酸盐；R₂为H或者OH；碱基为U，C，A，G或其衍生物；连接单元为在温和条件下可以断裂的双官能团化合物；荧光集团选自BODIPY、荧光素、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、alexa、squarene染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物中的一种。

优选地，所述可逆终端的结构式如式(II)所示：

优选地，所述可逆终端(II)是通过如下步骤合成的：

A、化合物F₂的合成：在冰水浴搅拌条件下，摩尔比为1.0：(1.2～2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应，得化合物F₂

B、化合物F₃的合成：在CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA存在的条件下，化合物F₂和F₁(CAS号为：172163-62-1，名称为：7-去氮杂-7-碘-2’-脱氧鸟苷)反应，得化合物F₃所述化合物F₁、化合物F₂、CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA的摩尔比为1：(2～3)：0.072：0.025：(1.5～2)；

C、化合物dUTP-NH₂的合成：化合物F₃与三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dUTP-NH₂所述三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮和化合物F₃的摩尔比为2：2：1；

D、化合物dUTP-SPDP的合成：在TEA存在的条件下，化合物dUTP-NH₂在碳酸钠碳酸氢钠缓冲液中，与以无水乙腈为溶剂的SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应，得化合物dUTP-SPDP所述的化合物dUTP-NH₂和SPDP的摩尔比为1：(1.5～3)；