[发明专利]一种在猪细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种在猪细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用。

背景技术

猪流感是由猪流感病毒引起的猪的一种急性、热性和高度接触性呼吸道传染病，临床上以突发高热、咳嗽、呼吸困难、机体衰竭甚至死亡为特征。猪流感给养猪业带来了极大的危害。此外，由于猪上呼吸道中同时存在禽流感受体和人流感受体，因此，猪对禽流感和人流感病毒也易感，被认为是流感病毒的“混合器”和禽流感病毒适应人的“中间宿主”。不同来源的流感病毒在猪体内可发生点突变或重排，所产生的新型病毒可能给公共卫生安全构成极大威胁。历史上的几次流感大流行都被认为与猪有着直接或间接的关系。

流感病毒的核糖核蛋白复合体（RNP）是病毒复制和转录所需的最小的分子复合物，其包括病毒基因组RNA、核蛋白（NP蛋白）和聚合酶复合体（PB2、PB1、PA），具有依赖RNA的RNA聚合酶活性。流感病毒的聚合酶活性在病毒致病性、宿主适应性及跨种间传播等多个生物学特性方面发挥着重要作用。较高的聚合酶活性是产生高致病性毒株的一个重要决定因子，病毒聚合酶活性增强，致病性也伴随着增强。另外，聚合酶活性在一定程度上也能反映RNP各基因片段之间的兼容程度，而RNP复合体的兼容性是限制病毒重排的一个关键因素。

检测流感病毒聚合酶活性的经典方法是利用双荧光素酶报告基因检测系统，该系统是一个基于体外细胞的试验方法，所用到的材料包括流感PB1、PB2、PA和NP的表达质粒，报告基因质粒和内参基因质粒，研究所用的细胞，以及测定报告基因和内参基因的试剂盒。通过测定报告基因和内参基因的表达间接确定流感病毒聚合酶的活性。

传统的聚合酶活性测定系统所用的报告基因和内参基因，通常是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，但这两种荧光素酶不能分泌到细胞外，测定时需要裂解细胞，细胞是否裂解完全会影响聚合酶活性测定的准确性。另外，过去对聚合酶活性的测定通常是在人的293T细胞上完成，并且使用的报告基因质粒的启动子是人源启动子，具有人源启动子的报告基因不能准确反应病毒在其他宿主细胞上的聚合酶活性。

由于猪在流感病毒生态链中的特殊地位，流感研究中迫切需要一种测定病毒在猪细胞中RNA聚合酶活性的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种在猪细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用。

本发明提供的一种质粒，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述质粒在制备检测病毒RNA聚合酶活性的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述病毒为流感病毒。

上述任一所述的应用中，所述流感病毒为猪流感病毒、禽流感病毒和/或人流感病毒。

上述任一所述的应用中，所述猪流感病毒为猪H1N2流感病毒，所述禽流感病毒为禽H9N2流感病毒，所述人流感病毒为人H1N1流感病毒。

上述任一所述的应用中，所述检测病毒RNA聚合酶活性为检测所述病毒的RNA聚合酶在猪细胞中的RNA聚合酶活性。

一种用于检测病毒RNA聚合酶活性的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包括上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP、猪细胞、分别连接待测病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒。

上述试剂盒中，所述分别连接待测病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒，是将所述待测病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白或待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白的基因分别插入pcDNA3.1(+)的多克隆位点得到的。

所述猪细胞为猪肾脏细胞PK15。

上述任一所述的试剂盒中，所述试剂盒还包括检测Gaussia荧光素酶的活性的产品和检测分泌型碱性磷酸酶活性的产品。

一种检测待测病毒RNA聚合酶在猪细胞中RNA聚合酶活性的方法也属于本发明的保护范围，该方法是利用上述任一所述的试剂盒进行检测的，包括如下步骤：