[发明专利]基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法

说明书

技术领域

本发明属于动物免疫学检测技术领域，特别是涉及一种口蹄疫A型VP1蛋白及其制备方法，以及一种基于制备得到的口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的高传染性且具有重要经济意义的动物疫病，感染牛、猪、绵羊、山羊和其他的偶蹄动物。动物感染口蹄疫后，口、蹄、乳头等部位会出现水泡形成糜烂，发病的动物一般是呈良性经过。口蹄疫虽然死亡率低，但是由于其发病率高几乎达到100%，且传播速度很快，制约了畜牧业的发展以及国家之间参与动物和动物产品的国际贸易，OIE将其列为A类动物疫病。

口蹄疫存在着七个血清型（O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和 Asia1）和80多个亚型，每个血清型中有各自的抗原性和流行特征，不存在交叉免疫，即免疫一种血清型疫苗不能抵抗另外一种血清型；各血清型中还有其不同的基因型，抗原性也存在一定程度的不同。这种多样性主要由于病毒的高突变率和重组性，也给口蹄疫疾病的诊断、控制和根除带来了困难。O型是全球范围内最流行的血清型，遍及中东南亚国家； Asia1开始只局限于亚洲，近年来已经逐步入侵到了中东国家；A型抗原最具多样性，相对其它血清型更容易发生重组，主要在亚洲、欧洲、非洲和拉丁美洲分布；南非1、2、3型（SAT1-3）主要在非洲流行。

我国自从1958年首次报道发生O、A、Asia-I这三种血清型的口蹄疫，其后偶尔有发生。A型口蹄疫在1964年从苏联传入了新疆地区再次引起流行，而后没有发生大规模的流行。直到2009年在湖北武汉暴发A型口蹄疫，这次流行的毒株根据口蹄疫VP1基因遗传进化分析证实与2008-2009年在东南亚国家分离的毒株相似（泰国、马来西亚），同属于A/ASIA/Sea-97谱系；同年在中国的上海、山东、江苏、广西、贵州和新疆六个省也报道了A型口蹄疫的暴发，2010年在无口蹄疫非免疫地区的韩国也同样出现了。Nick J. Knowles^[20]等报道近年来东南亚国家A型口蹄疫的流行继O和Asia1型之后再次引起了东亚地区的暴发，口蹄疫这种跨国的传播，使我国的口蹄疫疫情更为复杂，防疫工作更为严谨，对A型口蹄疫的研究应更为深入。广西地处中国大陆的南端，与东南亚国家相邻，东盟贸易区的自由化，面临着入侵的威胁，这需要我们做好口蹄疫监测和防控工作。

ELISA是enzyme linked immuno-sorbent assay的缩写，即酶连免疫吸附实验，是当今口蹄疫抗体检测的一个重要方法，该方法分为液相阻断ELISA（LPB-ELISA），和固相竞争ELISA（SPC-ELISA）。其中SPC-ELISA以其高敏感性和高相关性，正逐渐成为主流的口蹄疫抗体检测方法。但是SPC-ELISA的弱点是操作比较复杂，即使是有经验的操作人员也得需要4-5小时才能完成。目前对于口蹄疫方面的研究情况，如专利CN201110001730.X，该发明将口蹄疫抗体通过包被技术结合在ELISA板上，然后通过抗原-抗体结合反应将口蹄疫抗原牢固结合ELISA板孔内，经稳定剂处理和干燥后进行真空包装，最后置低温长期保存，当需要检测口蹄疫抗体时，可以将该ELISA板直接用于实验，但该发明的ELISA板长期保存，将对于该检测方法产生一定的误差，并且不能将O、A、Asia-I这三种血清型的口蹄疫区分开，不利于推广使用。

发明内容

本发明的目的是针对现有口蹄疫A型血清的检测技术存在检测成本高、检测操作麻烦、结果误差大等不足，提供一种基于口蹄疫A型VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法，发明涉及到A型口蹄疫蛋白VP1单克隆抗体的制备，及其运用于病原、抗体的检测和疫苗的研制等；建立了单抗竞争ELISA的方法来检测A型抗体，形成A型口蹄疫免疫监测技术平台。

本发明实现的技术方案为：一种口蹄疫A型VP1蛋白，包括两种不同表达方式得到的口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2，口蹄疫A型VP1蛋白1和口蹄疫A型VP1蛋白2氨基酸序列均为SEQ ID NO:1所示。