[发明专利]一种化学发光测定磺胺二甲嘧啶的方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学和化学发光领域，具体涉一种化学发光测定磺胺二甲嘧啶的方法。

背景技术

磺胺类药物为广谱抑菌剂，在结构上类似对氨基苯甲酸(PABA)，可与PABA竞争性作用于细菌体内的二叶酸合成酶，从而阻止PABA作为原料合成细菌所需要叶酸的过程，减少了具有代谢活性的四氢叶酸的量，而后者则是细菌合成嘌吟、胸腺嘧啶核苷和脱氧核糖核酸(DNA)的必需物质，因此抑制了细菌的生长繁殖。磺胺药的作用可被PABA及其衍生物（普鲁卡因、丁卡因）所拮抗，此外脓液以及组织的分解产物的存在也起拮抗作用，因其可提供细菌生长的必需物质。

白色或微黄色结晶或粉末，无臭，味微苦，遇光色渐变暗。本品在热乙醇中溶解，在水或乙醚中几乎不溶；在稀酸或稀碱溶液中易溶。用作饲料添加剂，用于防治葡萄球菌及溶血性链球菌等的感染，即主要治疗禽霍乱、禽伤寒，鸡球虫病等。用于防治葡萄球菌及溶解性链球菌等的感染，对溶血性链球菌及胸膜炎球菌等细菌有抑制作用，主要治疗禽霍乱、禽伤寒、鸡球虫病等。用作抗菌剂，用于防治葡萄球菌及溶血性链球菌等的感染，适用于治疗溶血性链球菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌等感染。主要用于治疗禽霍乱、禽伤寒、鸡球虫病等。

  目前发展的磺胺二甲嘧啶检测方法包括酶联免疫法、质谱法、表面增强拉曼光谱法、纳米金颗粒比色法和电化学方法等。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对磺胺二甲嘧啶的检测要求，但方法或者灵敏度不高、或者需要昂贵的仪器。

草酸酯化学发光体系应能产生高效的化学光，具有良好的贮存稳定性并且是安全的。其中含有叔醇的“过氧化氢组分”，一直以来被认为是最佳配方而被广泛应用。但是此含有叔醇的“过氧化氢组分”贮存稳定性较低、光输出密度不高，尤其是存在着组分闪点低、蒸气压高、安全性不佳等应予改进的缺陷。

化学发光检测既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作，且测试中不使用有害的试剂，试剂保质期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。目前市售的化学发光免疫检测试剂盒中的酶促化学发光底物系统的缺点在于：检测的灵敏度和特异性不够高、试剂稳定性不够、成本较高、检测不够简便快捷等等。所以必须发展一种灵敏度高，简单的新型检测方法。

发明内容

当有目标物磺胺二甲嘧啶存在时，通过功能化的磁珠作用，在修饰HRP的HRP-R1和HRP-R2存在下进行链式杂交反应，发生磁性分离，再利用HRP对化学发光体系的催化作用产生化学发光，通过测定化学发光强度实现对磺胺二甲嘧啶的测定。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种化学发光测定磺胺二甲嘧啶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）液态组分1的制备：将磁性金纳米粒子用磷酸缓冲液洗涤后，加入250 μl 0.01M 草酸酯、0.5×10^-5 M的催化剂和至少0.0001M 荧光剂，在37°C下反应12小时；将所得的功能化磁性金纳米粒子用磷酸盐缓冲液洗涤，然后分散在磷酸盐缓冲液中，保存在5°C下备用；

（2）液态组分2的制备：将磁性金纳米粒子用磷酸缓冲液洗涤后，120 μl 1.0×10^-5 M的溶于聚乙二醇的过氧化氢，在37°C下反应12小时；将所得的功能化磁性金纳米粒子用磷酸盐缓冲液洗涤，然后分散在磷酸盐缓冲液中，保存在5°C下备用；

（3）制备HRP（辣根过氧化物酶）修饰的R1：在150 μl 1.0×10^-5 M的甘氨酸、50 μl 0.003M的DTPA和80 μl 0.006M的苯甲酸钠混合液中加入15 mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），在37 °C下搅拌2小时，然后加入130 μl HRP，在37 °C下搅拌24h；

（4）制备HRP修饰的R2：在120 μl 1.0×10^-5 M的3- 氯-4 羟基乙酰苯胺、130 μl 0.5×10^-5 M四水合过硼酸钠中加入12 mg NHS，在37 °C下搅拌1小时，然后加入100 μl HRP，在37 °C下搅拌24h；