[发明专利]黄曲霉菌LAMP检测引物及其可视化检测方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种黄曲霉菌LAMP检测引物及其可视化检测方法，专用于黄曲霉菌快速可视化检测，同时可用于自然发病的花生或玉米组织中早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于有害生物检测、鉴定领域。

背景技术

    黄曲霉毒素（Aflatoxin）是黄曲霉和寄生曲霉生长繁殖过程中产生的真菌次生代谢产物，它是所有真菌毒素中对环境污染最严重，对人畜危害最大的一种毒素，具有致癌、致畸、致突变作用，主要以侵染花生、玉米、大豆、小麦、坚果等农作物及其制品为主，被其侵染的食品及饲料大部分都失去营养价值和经济价值，因此，各国为了保护国民的身体健康及农牧业的经济利益都制定了毒素的限量标准，黄曲霉毒素限量已成为农产品出口的技术壁垒。黄曲霉及其毒素污染不仅直接危害人们的健康，而且影响农作物的品质和外贸出口，所以人们一直设法采取各种措施防止其污染，可迄今为止还没有一种理想的方法。国内外研究的焦点主要集中在黄曲霉毒素的检测方法，而对产黄曲霉毒素菌的分子检测技术鲜有报道。传统曲霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性和血清学反应鉴定等，目前对黄曲霉菌的检测大多仍沿用传统的培养及鉴定方法，传统的病原菌检测技术是在分离得到病原物的基础上，通过形态学观察和柯赫氏法则来判断病原物的种类。整个过程常常需要耗费大量的劳动力和时间，一般需要几天才能完成。而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术，由于其耗时长，效率低，而且容易出现假阳性或假阴性结果，难以满足对黄曲霉病快速敏感诊断的实际需要，很容易错过病害防治的最佳时期。因此，建立一种快速、灵敏、准确的黄曲霉检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，然而目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了PCR检测方法的推广应用。循环恒温扩增技术（Ioop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温条件下（60–65℃）保温30–90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可将扩增10⁹–10¹⁰倍。LAMP扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，黄曲霉菌的LAMP可视化检测国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中黄曲霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种黄曲霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的黄曲霉菌的可视化检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种黄曲霉菌LAMP检测引物，其特征在于引物序列如下：

      外侧引物 F3：GTGAATTGCAGAATTCCGTGAA

               B3：CCTACAGAGCGGGTGACAA 

    内侧引物 FIP：ATGACGCTCGGACAGGCATG-ATCGAGTCTTTGAACGCACA

    BIP：TTGGGTCGTCGTCCCCTCTC-CCCCATACGCTCGAGGAT。

    一种利用权利要求1的引物的黄曲霉菌LAMP可视化检测方法，其特征在于： LAMP反应体系为：外侧引物F3 5uM和B3 5uM 各0.25uL，内侧引物FIP 40uM 和BIP 40uM 各0.25uL，12.5uL反应混合液，1uL 显色剂，1uL 8U BstDNA 聚合酶，25ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足到25 uL。