[发明专利]人免疫缺陷病毒-1NASBA-ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的NASBA(Nucleic Acid Sequence-based Amplification，依赖核酸序列扩增)试剂盒，尤其涉及人免疫缺陷病毒-1 NASBA-ELISA 检测试剂盒。 

背景技术

获得性免疫缺陷综合症是由人免疫陷病毒（HIV）引起的一种严重危害人类健康的致死性传染病。根据病毒核酸测序将HIV分为HIV-1和HIV-2两型，其中HIV-1是目前全球流行主要毒株，具有很强变异性，分子流行病学调查结果显示，我国已经成为HIV-1流行最多的国家之一。目前国际上建立了一系列用于检测HIV病原体的方法，其中最常应用检测HIV-1的方法是抗体检测，但从人体感染HIV到血液出现HIV特异性抗体有一个约为1～3个月“窗口期”，该时期内病人无法确认自己是否感染，故无法对HIV-1实现早期诊断。对病原体进行核酸检测可以缩短检测的窗口期做到早期诊断,常用的核酸检测方法主要有real time RT-PCR 、RT-PCR等。但real time RT-PCR因需要昂贵的荧光定量PCR仪而限制了其在发展中国家广泛推广；而普通RT-PCR虽对设备要求较低，但较容易出现假阳性结果，不能很好地满足临床需要。 

核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一项成熟的恒温RNA扩增技术，现已广泛应用于肝炎病毒、狂犬病病毒、禽流感病毒等病原体的快速检测。其中检测禽流感病毒的NASBA方法已被列为国家诊断标准方法之一。本发明在NASBA扩增HIV-1 RNA的基础上结合寡核苷酸液相分子杂交和酶标显色反应，建立了用于检测HIV-1型病毒的NASBA-ELISA方法。 

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种HIV-1 NASBA-ELISA检测试剂盒。 

本发明的目的是这样实现的： 

1、HIV-1 NASBA-ELISA检测试剂盒

本试剂盒是在对HIV-1序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出

一对特异性引物和一条特异性探针，利用NASBA技术对HIV-1进行检测。此技术仅需要常规的酶标仪和水浴锅便能完成对临床样本的检验，能够将分子诊断技术在基层医疗机构推广，具有潜在的应用价值。

具体的说，本试剂盒包括HIV-1的一对特异性引物、一条特异性荧光探针、阳性对照、阴性对照、NASBA Buffer 、Enzyme Mix、NASBA 产物检测试剂。 

①HIV-1基因的一对特异性引物 

F:5’-TGATGCAAGGTCGATATGAGCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’， 下划线部分与检测探针互补；R: 5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGG

GGGCGCCACTGCTAGAGA-3’，下划线部分为T7启动子序列。

②HIV-1基因的探针 

捕获探针：5’-Biotin-TCTGGTAACTAGAGATCCCTC-3’，为基因特异探针。检测探针：5’-DIG-TGATGCAAGGTCGATATGAG-3’。

③阳性对照 

人免疫缺陷病毒-1型的患者血清；

④阴性对照

不含人免疫缺陷病毒-1型的正常人血清 ；

⑤NASBA 扩增试剂：

扩增缓冲液：40 mmol/I，pH8.5 Tris-HC1，120 mmol/L KCl，10 mmol/L MgC1，5 mmol/L DTT，1 mmol/L dNTP，10 mmol/L NTP，100 g/L DMSO。

酶混合液：含40U SupeScript II反转录酶、80U T7 RNA聚合酶、0.2U 核糖核酸酶H 

⑥NASBA 产物检测试剂

96 孔酶标板：链酶亲和素包被的酶标板

杂交缓冲液：20×SSPE（ pH7.4），50mM/L Tris-HCl ( pH8.8)，1﹪ （W/V）BSA 43μl

酶标抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体 100μl

洗液：PBST 溶液（含0.05%Tween-20，pH7.2，PBS） 450μl。

显色液：3mg pNPP 溶于1mLddH2O 中, 加入1mL二乙醇胺，避光-20℃保存 ，100μl