[发明专利]一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种针对登革热病毒核酸的快速检测技术，适合对登革热病毒(I，II，III和VI型)的定性检测。

背景技术

登革热是由登革热病毒所引起的一种传染病，它是由属于黑斑蚊(也称艾迪斯蚊、伊蚊)的白线斑蚊(Aedes albopictus)与埃及斑蚊(Aedes aegypti)先叮咬患者后，成为“病媒蚊”，其它健康的人可能因这只病媒蚊叮咬而感染。有可能出现极度疲倦及抑郁症状，偶然病者会恶化至登革溢血热，并进一步出血、休克，甚至死亡。登革热产生的并发症往往是病人致死的主因。一般来说登革热主要分布在热带及亚热带地区。

登革热病毒广泛分布在北纬25度与南纬25度间，至1980年止，全球亚热带地区，有活动性登革热病毒传播的国家多达61个；广泛流行于全球热带及亚热带的60多个国家和地区，每年超过一亿人受感染，25亿以上的人受到威胁。登革病毒的传播现已经成为热带、亚热带地区严重的公共卫生问题。登革热影响所有年龄的人，但是大部分的登革溢血热却发生在年龄15岁以下的儿童。

近年来的发展起来针对登革热病毒的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优点在登革热病毒的基因检测水平上有着广泛的应用，是目前登革热病毒检测的主要方法，目前国内市场上已经有了关于登革热病毒核酸定量检测试剂盒。

FQ-PCR虽然有着简便，快速，灵敏的优势，但是其检测需要昂贵的仪器，且容易造成假阳性等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确、灵敏、快速地检测登革热核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

登革热病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒，包括如下部分：

a)RNA提取液：德国QIAGEN RNA提取试剂盒(Qia-14162)

b)恒温扩增反应液：

包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermol buffer、MgSO₄、dNTPs溶液、1×RNA secure、Bst DNA聚合酶(8U)、AMV逆转录酶(1U)和DEPC水，其中：

所述的外围引物分别为：

正向外围引物序列为5’-ACTATGCTGCCTGTAGCTCC-3’；

反向外围引物序列为5’-CTGGAATGATGCTGAGGAGAC-3’；

所述的两条探针的序列分别为：

正向5’端生物素(Biotin)标记探针：5’-Biotin-CACTACGCCATGCGTACAGC-3’

反向3’端异硫氰酸荧光素(Fitc)标记探针：5’-AGCGTCAATATGCTGTTTTTTG-Fitc-3’：

所述的扩增交叉引物分别为：

扩增反向引物5’-GGGAGGCCACAAACCATGGAGCAGGATCTCTGGTCTTTCC-3’

扩增正向引物5’-GCAGGATCTCTGGTCTTTCCGGGAGGCCACAAACCATGGA-3’

所述的1×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH8.8。

所述试剂盒还包括阳性对照模板，该阳性对照模板为含有登革热病毒POLYPROTEIN基因片段的转录产物。

本发明还提供一种采用上述试剂盒检测登革热病毒核酸的方法，包括下列步骤：

a)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA；

b)将步骤a)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60℃下扩增反应90分钟；对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照模板，所述阳性对照模板为含有登革热病毒POLYPROTEIN基因片段的转录产物，所述阴性对照模板为DEPC水；

c)将反应后的PCR管放置到防污染核酸检测装置(专利号：ZL200610109620.4)中进行检测，15分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有登革热病毒。

本试剂盒为交叉引物恒温扩增靶核苷酸序列的方法及其应用(专利号：ZL200810134583.1)的应用，其核酸扩增的工作原理如图1所示。