[发明专利]一种同时测定葡萄酒中原花青素和白藜芦醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品检验与分析领域，具体为一种测定葡萄酒中原花青素和白藜芦醇的方法。

背景技术

原花青素(procyanidins ,简称为PC) 是黄烷-3-醇衍生物的总称，主要有儿茶素的单体、二聚体、三聚体至十聚体组合而成。其特点为高效、低毒、高生物利用率，半致死量为LD50 = 3g/kg，是近年来不断研究开发的一种极强体内活性功能因子。许多研究表明，PC是清除自由基很强的抗氧化剂，其抗氧化，清除自由基的能力是VE的50倍，Vc的20倍，已引起人们的极大关注。它不仅广泛分布于植物中，如银杏、日本罗汉柏、北美崖柏、土耳其侧柏、花棋松、白桦村野生刺葵、日本莽草、耳叶番泻、海岸松、大黄、落叶松、莲房等，也存在于某些饮料、蔬菜、水果和粮食中，如葡萄、葡萄酒、苹果、苹果汁、啤酒、茶叶、大麦、麦芽、高梁、豆科植物、番荔枝、野草毒、樱桃等。在涉及的众多天然产中，葡萄及其制品中的PC含量丰富，故研究较多。目前该物质的定量测定方法包括滴定法、分光法、电化学法、化学发光法、毛细管电泳以及在铁盐酸化降解基础上的HPLC法。白藜芦醇（resveratrol）亦称芪三酚，是一种植物激素，值得注意的是它可以在葡萄酿造过程中，由于生物化学酶的催化反应生成。优质葡萄酒白藜芦醇的含量较高，而勾兑酒（葡萄汁加酒精）白藜芦醇含量为零。目前，研究表明它具有抗肿瘤、抗心血管疾病、治疗突变、抗氧化、抗菌抗炎、保肝、诱导细胞凋亡及雌激素调节等生物药理活性。目前这种物质的测定方法有高效液相色谱法、荧光法、化学发光法、毛细管电泳法、电化学法。

申请号为201210184125.5的中国专利曾公布了一种利用HPLC测定葡萄和柑橘果实中17种酚类物质的方法，即采用高效液相色谱法对葡萄以及柑橘果实中的没食子酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、芦丁、阿魏酸、橙皮苷、柚皮苷、水杨酸、槲皮素、川陈皮素、桔皮素、儿茶素、表儿茶素、苯甲酸、白藜芦醇进行测定，通过紫外检测器定性定量分析，但是采用紫外检测器，需对样品进行一系列复杂的提取与纯化程序，杂质干扰较多；并且由于采用了繁琐的萃取前处理技术，样品有所损失，测量精度不高。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在采用高效液相色谱串联二级阵列管检测器与荧光检测器，直接测定葡萄酒中的原花青素与白藜芦醇。其中荧光检测器能够通过激发波长与发射波长的调整，减小杂质的干扰，从而具有高选择性，其灵敏度远高于紫外检测器，可准确、可靠地对物质进行定量分析。

具体技术方案如下：一种测定葡萄酒中原花青素和白藜芦醇的方法，包括以下步骤：

（1）样品处理

取葡萄酒适量过有机滤膜后备用作为待测样品；

（2）高效液相色谱仪系统的测定

取适量待测样品加入高效液相色谱仪中，利用流动相对其进行梯度洗脱，然后利用二级管阵列检测器对样品中的原花青素和白藜芦醇进行定性分析，二级管阵列检测器的工作原理是复色光通过样品池被组分选择性吸收后再进入单射器，照射在二极管阵列装置上使每个纳米波长的光强度转变成相应的电信号强度，即获得组分的吸收光谱，从而获得特定组分的结构信息，有助于未知组分或复杂组分的结构确定，因此，可以根据目标物的色谱保留时间(R_t)与标准物质保留时间比较初步对化合物定性，同时利用目标物与标准物质的吸收光谱比较进一步定性，双重定性更为准确可靠；最后再利用荧光检测器对样品中的原花青素和白藜芦醇进行定量分析，荧光检测器是利用具有特殊结构的化合物收到紫外光激发（E_ex）后能发射出比激发光源波长更长的光（E_em）的荧光特性来检测的，许多有机化合物具有天然荧光活性，其中带有芳香基团的化合物具有荧光活性很强，在一定条件，荧光强度与物质浓度成正比，通过荧光的强度大小可以确定物质的浓度，它特别适合于稠环芳烃、甾族化合物等，原花青素与白藜芦醇均具有稠环芳烃结构。荧光检测器灵敏度高、选择性好，比紫外检测器高出2-3个数量级。

（3）通过标准曲线定量

分别称取适量原花青素和白藜芦醇标准品，利用甲醇溶解和定容，依次配置两标准品的混合溶液，其中，原花青素浓度依次为0.0100、0.0500、0.100、0.150、0.200、0.250mg/ml，白藜芦醇的浓度依次为1.00、5.00、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0μg/ml，将混合溶液重复步骤（2）进行测定，所得数据以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到峰面积-浓度标准曲线，由此曲线来确定样品中原花青素和白藜芦醇的含量。