[发明专利]一种发酵液中分离纯化聚苹果酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对生物发酵液中聚苹果酸进行分离纯化的方法，属于生化工程领域。

背景技术

聚苹果酸是一种特殊的脂肪族聚酯，以苹果酸为唯一单体、相互通过酯键联接而成。它是天然多聚物中新近开发的一种生物多聚物。与许多其它天然多聚物不同，聚苹果酸分子中有许多自由羧基和非对称碳原子，这些自由羧基赋予了它许多特别的性质，它除了具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容性和生物可吸收性之外，还具有两个显著的优点：(1)易代谢性。由于L-苹果酸是生物体内克雷伯氏三羧酸循环的中间体，β-聚苹果酸容易在生物体内通过正常的三羧酸循环代谢途径除去；(2)易修饰性。聚苹果酸具有悬挂羧基，容易与其它官能团反应而制得聚苹果酸衍生物，或引入功能基团或小分子药物，从而制得许多具有特殊功能的产物。因此，聚苹果酸及其衍生物可作为手术缝合线、组织工程支架材料、药物载体或原生药物、药物控制释放体系、食品包装材料、化妆品等，在生物医药、食品、化妆品等领域获得重要的应用，并且β-聚苹果酸有和β-聚羟基脂肪酸酯相关的非常吸引人的功能组成，未来可能发现它的新的应用，比如可以制备优良的可降解塑料，解决当前危害严重的“白色污染”问题，甚至可以代替石油来源的不能被生物降解的聚丙烯酸的短期应用。可以预料，聚苹果酸作为新型功能材料和生物结构材料定会获得很大的发展。

聚苹果酸能被某些微生物(真菌、黏菌、细菌等)先降解为低聚物，而后形成苹果酸等单体，并最终降解为二氧化碳和水。聚苹果酸的降解效率很快，在菌体内几个小时就能被全部降解为单体。

聚苹果酸的合成方法包括化学合成和微生物发酵法。通过化学合成可以得到3种类型的聚苹果酸，即a、β、γ3种类型；而微生物发酵法得到的聚苹果酸仅有β型。化学合成包括直接聚合法和内酯开环聚合法。化学合成方法的反应步骤复杂，化合时产生的副产物较多，分离较困难，而且含有毒物质(少量的催化剂)，制约了它的广泛应用。同化学合成相比，微生物发酵合成的聚苹果酸分子量较高，可达到200～760kDa，而化学合成的聚苹果酸分子量一般低于7kDa。此外，生物合成所需的原料简单易得，反应条件温和，近年来受到国内外的广泛关注。

国外对于聚苹果酸及其衍生物的研究开始于20世纪60年代，对于其性质、用途及其合成方法都有研究，合成方法主要集中于化学法，据报道在国外已有规模化的生产。在国内，对于聚苹果酸的研究非常少，相关报道也很少。迄今为止，以Vert、Cammas和Kajiyaina等为代表的国外学者已对聚苹果酸的合成、性能和应用做了较深入的研究；国内直到近年来才有几位学者对聚苹果酸以及苹果酸、乳酸共聚物的合成与性能做了一些基础研究。尽管目前聚苹果酸及其衍生物的研究远不如对其他羟基烷酸酯的研究那样深入，研究结果仍充分展示了这种新型的功能性脂肪族聚酯在生物医药、生物材料等领域的巨大应用前景。

短梗霉属和P.polycephalum已经被优化培养以制备聚苹果酸。细胞分泌多余的聚苹果酸到发酵液中。由短梗霉属合成的聚苹果酸是以聚苹果酸-葡聚糖结合体形式分泌的，另外还有一些被培养液中的酶分子为分子量5～11kDa的自由聚苹果酸。由P.polycephalum合成的聚苹果酸则是以纯聚苹果酸的形式分泌，分子量为50～300kDa。可以利用聚苹果酸在丙酮中的高溶解性去除它连结的葡萄糖，而从短梗霉得到聚苹果酸。保藏时间较长时，聚苹果酸的主链的酯键被自发地水解切断，使其分子具有不均一性。

聚苹果酸以钙盐或钠盐的形式被分离和纯化。聚苹果酸钙盐是通过在过量CaCO₃或缺少CaCO₃的情况下用甲醇反复沉淀而分离的。聚苹果酸的钠盐和钾盐是采用阴离子交换色谱分离得到的，流动相是KCl或NaCl，过量的盐是通过Sephadex G25而除去的。冻干样品是无定形、无色的粉末，浆状物和玻璃状物。在通过Amberlite120(H⁺)转化为酸，冻干，在温热(30℃-40℃)的丙酮中重新溶解后离心，减压去除溶剂后，高纯度的高分子看起来是玻璃状的，几分钟后就形成结晶中心。从P.polycephalum得到的聚苹果酸和它的钠盐是无色玻璃状无定形粉末。

要实现发酵法制备聚苹果酸的产业化，就必须对发酵液中的聚苹果酸的提取工艺进行优化。国内外多采用有机溶剂沉淀法提取聚苹果酸，但所得聚苹果酸多为粗品，无法用于后续的应用研究中。

本发明建立了一种发酵液中分离纯化聚苹果酸的生产工艺，具有提取工艺简单、能耗低、提取收率高、产品纯度高的优点，可显著降低从发酵液中提取聚苹果酸的成本。

发明内容