[发明专利]口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光RT-PCR检测方法的建立及其应用

权利要求书

1.一组同时检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的引物和探针，其特征在于特异性引物和探针序列分别为：

1)SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8所示的引物；

2)SEQ ID NO：3、6、9所示的探针。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于如SEQ NO：3所示的口蹄疫病毒3D蛋白的基因探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：6所示的水泡性口炎病毒N蛋白的基因探针5’端由ROX标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：9所示的猪水疱病病毒VP1蛋白的基因探针5’端由HEX标记，3’端由BHQ2标记。

3.权利要求1所述的引物和探针序列在制备检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的检测试剂中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的检测试剂，由权利要求1或2所述的引物和探针、多重荧光PCR缓冲液、氯化镁、dNTP、Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶和水组成；所述引物和所述探针在所述扩增检测中的终浓度均具体为0.2uM-0.4uM。

5.一种同时检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有如权利要求1所示的特异性引物和探针，其序列分别为：

1)SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8所示的引物；

2)SEQ ID NO：3、6、9所示的探针；

以及多重荧光PCR缓冲液、氯化镁、dNTP、Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶和水。

6.权利要求4所述的试剂盒在检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病中的应用，其特征在于可以检测到10²个拷贝的病毒。

7.一组同时检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的方法，其特征在于，

1)提取病毒RNA；

2)实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的25μLPCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中；

3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；

4)收集荧光信号，检测Ct值。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下：

成分用量(μL)PCR缓冲液(10×)5

氯化镁(25m mo1／L)5dNTPs(10mmol／L)5SEQ ID NO：1、2(15μmol／L)各0.75SEQ ID NO：4、5(15μmol／L)各1SEQ ID NO：7、8(15μmol／L)各1SEQ ID NO：3(10μmol／L)1SEQ ID NO：6(10μmol／L)1SEQ ID NO：9(10μmo1／L)1Taq DNA聚合酶(5U／μL)1AMV反转录酶(5U／μL)1模板各4ddH₂O12.5总计50

扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。